Examinarea microscopică a fecalelor. Baza legislativă a Federației Ruse

Scaunele sunt examinate în două moduri:

1. Macroscopic - găsiți helminți, capetele lor, segmente, resturi de strobili. Porțiuni mici de fecale sunt amestecate cu apă într-o baie plată sau cu vase Petri și privite la lumină bună pe un fundal întunecat, folosind o lupă dacă este necesar. Toate formațiunile suspecte sunt transferate cu o pensetă într-o altă cană de apă sau pe o lamă de sticlă într-o picătură de glicerină diluată.

Cu metoda sustinerea porțiunea investigată de fecale se amestecă cu apă într-un cilindru de sticlă, după decantare, se scurge strat superior apă. Acest lucru se repetă de mai multe ori. Când lichidul devine transparent, acesta este scurs, iar sedimentul este văzut într-o cutie Petri.

2. Microscopic - pentru a detecta ouăle și larvele de helminți. Există multe metode de cercetare.

unu). frotiu nativ - metoda de cercetare cea mai comună și disponibilă tehnic. Puteți găsi ouă și larve ale tuturor helminților. Cu toate acestea, cu un număr mic de ouă, acestea nu se găsesc întotdeauna. Prin urmare, se utilizează metoda de îmbogățire.

unu). metoda Fülleborg - aceasta este o metodă de îmbogățire, bazată pe apariția ouălor de helmintiază într-o soluție saturată de NaCl (1,2 - densitate; 400 g NaCl la 1 litru de apă; soluție NaCl 40%). Metoda este mai eficientă decât frotiul nativ. 2-5 g de fecale se pun în borcane de sticlă și se umplu cu soluție de NaCl, se agită, iar după 45 de minute pelicula formată se îndepărtează cu o buclă de metal, se pune o picătură de glicerină pe o lamă de sticlă. Examinați la microscop. Dezavantajul metodei este apariția întârziată a ouălor diverșilor helminți, tenia pitică - după 15-20 de minute, viermi rotunzi - 1,5 ore, viermi bici - 2-3 ore.

2) Metoda Kalantaryană - tot o metodă de îmbogățire, dar se folosește o soluție saturată de NaNO 3 (densitate 1,38). Majoritatea ouălor plutesc, nu este necesară examinarea sedimentului. Dezavantajul este că ouăle sunt ținute în soluție timp îndelungat, ceea ce duce la faptul că unele ouă încep să se umfle și să se așeze pe fund, dispărând din pelicula de suprafață.

3. Metoda lui Goriaciov - pe principiul depunerii ouălor, depistarea ouălor mici de trematode. O soluție saturată de NaCl este utilizată ca soluție și 3-4 ml de soluție de fecale sunt stratificate cu grijă deasupra. După 15-20 de ore, ouăle de trematode se așează pe fund. Se scurge lichidul, se sedimentează pe o lamă de sticlă și la microscop.

4. Metoda de răsucire Shulman – pentru a detecta larvele de helminți în fecale. Examinați numai fecalele proaspăt izolate. Se pun 2-3 g într-un borcan de sticlă și se adaugă de 5 ori cantitatea de apă, se amestecă rapid cu un bețișor, fără să se atingă pereții borcanului - 20-30 de minute, apoi se scoate rapid bețișorul, iar o picătură de lichidul la sfârșit este transferat pe o lamă de sticlă și microscopat.

5. Metoda Berman - se bazează pe capacitatea larvelor de helminți de a migra către căldură și servește la identificarea lor în fecale.

6. Metoda lui Harada și Mori (metoda de creștere a larvelor) și este recomandată pentru testarea anchilostomiei. Metoda se bazează pe faptul că, la căldură și pe hârtie filtrată umedă, ouăle de anchilostoma se dezvoltă în larve filariforme, care pot fi ușor detectate. Pe mijlocul unei benzi de hârtie filtrată se aplică 15 g de fecale, hârtia cu fecale se pune într-un borcan, astfel încât capătul inferior să fie scufundat în apă, iar capătul superior să fie fixat cu un dop. Borcanul se tine intr-un termostat la 28 0 C timp de 5-6 zile. Larvele filariforme se dezvoltă în acest timp și coboară în apă. Lichidul este examinat cu o lupă. Dacă este dificil de detectat, lichidul este centrifugat, după uciderea larvelor prin încălzire la 60 0. Tehnicianul de laborator trebuie să poarte mănuși.

7. Metode pentru enterobiaza – detectarea ouălor de oxiuri și tenia taurului.

a) răzuire din pliurile perianale - cu un tampon de vată înfășurat strâns pe un băț de lemn și umezit cu o soluție de glicerină 50%. În laborator, tamponul este spălat cu 1-2 picături dintr-o soluție apoasă 50% de glicerol.

b) metoda acarienilor lipicios (metoda Graham)

Banda adezivă se aplică pe pliurile perianale, apoi cu un strat lipicios pe lama de sticlă și se microscopează.

C) răzuire cu ajutorul bețișoarelor de ochi (metoda lui Rabinovici). Pentru răzuirea perianală, se folosesc bețișoare de ochi de sticlă, cea mai largă parte a cărora este acoperită cu un adeziv special, care face posibilă ținerea ouălor de oxiuri.

Examinarea sângelui, bilei, sputei și mușchilor

Microscopie sanguină - sunt detectate larve de filarii.

Examinarea sputei - ouă de paraganim, larve de viermi rotunzi, necator, strongiloid, elemente ale vezicii echinococice.

Examinarea mușchilor - dacă se suspectează trichineloza, se examinează mușchii pacientului sau cadavrul, precum și carnea care ar fi cauzat infecția persoanei. În scopul trichinoscopiei, mușchiul este tăiat în bucăți mici și plasat în compresoare, acestea sunt două pahare largi și groase care zdrobesc mușchii și larvele de Trichinella se găsesc sub formă de capsule - metoda compresiei.

Metoda de digestie - mușchii sunt turnați cu suc gastric artificial (soluție de acid clorhidricși pepsină). Mușchii sunt digerați și larvele sunt ușor de identificat. Determinarea intensității invaziei: numărul de larve până la 200 la 1 g tesut muscular– intensitate moderată a invaziei; până la 500 - intensiv; peste 500 - invazie superintensiva.

Metode serologice

7.7. Metode de determinare a viabilității ouălor și a larvelor de helminți

Viabilitatea ouălor de helminți este determinată de aspect, prin colorarea cu coloranți vitali, cultivarea în condiții optime și constituirea unei probe biologice.

7.7.1. Determinarea viabilității ouălor sau larvelor de helminți după aspect

Ouăle de helminți sunt microscopate mai întâi la mărire mică, apoi la mărire mare. În ouăle deformate și moarte ale helminților, coaja este ruptă sau îndoită spre interior, plasma este tulbure, slăbită. Ouăle segmentate au bile de clivaj (blastomere) de dimensiuni inegale, formă neregulată, sunt deseori deplasate la un singur pol. Uneori există ouă anormale, care, având deformări externe, se dezvoltă normal. Larvele vii de ascaride au granulație fină doar în partea de mijloc a corpului, pe măsură ce mor, se răspândește în tot corpul, apar vacuole mari hialine strălucitoare, așa-numitele „șiruri de perle”.

Pentru a determina viabilitatea ouălor mature de viermi rotunzi, viermi bici, oxiuri, trebuie numite mișcări active. larvele usorîncălzirea medicamentului (la o temperatură care nu depășește 37 ° C). Este mai convenabil să se observe viabilitatea larvelor de ascaris și tricoceluș după ce acestea sunt izolate din coaja ouălor prin apăsarea pe paharul preparatului cu un ac de disecție sau o pensetă.

La larvele invazive de ascaride, se observă adesea un capac care s-a exfoliat la capătul capului, iar la larvele de viermi bici care și-au finalizat dezvoltarea în ou, se găsește un stilt în acest loc la mărire mare. Larvele moarte de helminți, indiferent de locația lor (în ou sau în afara acestuia), observă degradarea corpului. În acest caz, structura internă a larvei devine noduloasă sau granulară, iar corpul devine tulbure și opac. Vacuolele se găsesc în corp, iar rupturi se găsesc pe cuticulă.

Viabilitatea oncosferelor teniide (tenii bovine, porcine etc.) este determinată de mișcarea embrionilor atunci când sunt expuși la enzime digestive. Ouăle se pun pe un pahar de ceas suc gastric câini sau suc duodenal artificial. Compoziția acestuia din urmă: pancreatina - 0,5 g, bicarbonat de sodiu - 0,09 g, apă distilată - 5 ml. Paharele de ceas cu ouă se pun într-un termostat la 36 - 38 ° C timp de 4 ore. În acest caz, embrionii vii sunt eliberați din membrane. Învelișurile oncosferelor vii se dizolvă și în pepsină acidulată și într-o soluție alcalină de tripsină după 6-8 ore într-un termostat la 38 °C.

Dacă ouăle de teniid sunt plasate într-o soluție de 1% de sulfură de sodiu sau o soluție de 20% de hipoclorit de sodiu sau într-o soluție de 1% de apă cu clor la 36 - 38 ° C, embrionii maturi și vii sunt eliberați din cochilie și nu schimbare pe parcursul unei zile. Oncosferele imature și moarte se zboară sau se umflă și se măresc dramatic și apoi se „dizolvă” în decurs de 10 minute până la 2 ore. De asemenea, embrionii vii de teniide se mișcă activ într-un amestec de soluție de clorură de sodiu 1%, soluție de bicarbonat de sodiu 0,5% și bilă la 36 - 38 ° C.

Viabilitatea fasciol adolescaria colectată pe plante și alte obiecte ale corpurilor de apă este verificată prin examinarea lor pe o lamă de sticlă în ser fiziologic salin sub un microscop cu etaj încălzit. Când sunt încălzite, larvele trematode din chist încep să se miște.

Pentru a determina viabilitatea ouălor teniei pigmeu, metoda lui Ionina N.S. este cea mai simplă: la ouăle vii, perechea mediană de cârlige embrionare este fie paralelă cu cele laterale, fie acestea din urmă formează un unghi la baza mai puțin. de 45 ° cu mediana. În ouăle moarte, perechile laterale formează un unghi la bază cu o pereche mediană de mai mult de 45 °, sau cârligele sunt împrăștiate aleatoriu (aranjamentul lor pereche se pierde); uneori apare încrețirea embrionului, formarea granularității. O metodă mai precisă se bazează pe apariția mișcărilor oncosferei în timpul unei schimbări bruște a temperaturii: de la 5 - 10 ° la 38 - 40 ° C.

Determinarea viabilității ouălor imature de nematod ar trebui studiată într-o cameră umedă (cube Petri), plasând ouăle de ascaris într-o soluție de formol 3% preparată într-o soluție izotonă de clorură de sodiu la o temperatură de 24 - 30 ° C, ouă de vierme într-un 3. % soluție de acid clorhidric la o temperatură de 30 - 35 ° C; ouă de oxiuri în soluție izotonică de clorură de sodiu la 37 °C. Cutiile Petri trebuie deschise de 1 - 2 ori pe săptămână pentru o mai bună aerare și umeziți din nou hârtia de filtru apă curată.

Observațiile dezvoltării ouălor de helminți se efectuează de cel puțin 2 ori pe săptămână. Absența semnelor de dezvoltare în 2-3 luni indică non-viabilitatea acestora. Semnele dezvoltării ouălor de helminți sunt mai întâi etapele zdrobirii, împărțirea conținutului oului în blastomeri separate. În primele zile se dezvoltă până la 16 blastomeri, care trec în a doua etapă - morula etc.

Ouăle de anchilostoma se cultivă într-un cilindru de sticlă (50 cm înălțime și 7 cm în diametru) închis cu dop. Un amestec de volume egale nisip steril, cărbune și fecale cu ouă de vierme, diluate cu apă până la o consistență semi-lichidă, se toarnă cu grijă pe fundul cilindrului folosind un tub de sticlă. În 1 - 2 zile de așezare în întuneric la o temperatură de 25 - 30 ° C, larvele asemănătoare rabditei eclozează din ouă, iar după 5 - 7 zile devin deja filariforme: larvele se târăsc pe pereții cilindrului, unde sunt vizibile chiar și cu ochiul liber.

Ouăle de trematode care se dezvoltă în mod natural în apă, cum ar fi opisthorchis, difilobotriide, fascioli și altele, sunt așezate pe un pahar de ceas, o placă Petri sau într-un alt vas și se toarnă un strat mic de apă obișnuită. La cultivarea ouălor de fasciola, trebuie luat în considerare faptul că acestea se dezvoltă mai repede în întuneric, în timp ce miracidiumul se formează în ouăle vii la o temperatură de 22–24 ° C după 9–12 zile. La microscopia ouălor trematode în curs de dezvoltare, mișcările miracidium sunt clar vizibile. Fasciola miracidium iese din cojile ouă doar la lumină.

Metoda Fulleborn. Larvele de anchilostoma și strongylid sunt cultivate pe agar într-o cutie Petri cu cărbune animal. După păstrarea într-un termostat la o temperatură de 25 - 30 ° C timp de 5 - 6 ore, larvele se răspândesc peste agar, lăsând în urmă o cale de bacterii.

Metoda lui Harada și Mori. Se adaugă 7 ml apă distilată în eprubete plasate într-un suport. Luați 0,5 g de fecale cu un băț de lemn și faceți un frotiu pe hârtie de filtru (15 x 150 mm) la 5 cm de marginea din stânga (această operațiune se realizează pe o foaie de hârtie pentru a proteja suprafața mesei de laborator). Apoi banda cu frotiu este introdusă în tub, astfel încât capătul stâng liber de frotiu să ajungă la fundul tubului. Acoperiți capătul superior cu o bucată de celofan și înfășurați-l strâns cu o bandă elastică. Pe eprubetă scrieți numărul, numele subiectului. În această stare, eprubetele se păstrează timp de 8-10 zile la o temperatură de 28 °C. Pentru a studia larvele, scoateți și îndepărtați capacul de celofan și îndepărtați o bandă de hârtie de filtru cu penseta. Procedând astfel, trebuie avut grijă, ca un numar mare de larvele invazive se pot deplasa la capătul superior al hârtiei de filtru sau pe peretele eprubetei și pot pătrunde sub suprafața celofanului.

Tuburile se pun într-o baie de apă fierbinte la 50°C timp de 15 minute, după care conținutul se agită și se toarnă rapid într-un tub de sedimentare larvară de 15 ml. După centrifugare, supernatantul este îndepărtat, iar precipitatul este transferat pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamelă și microscopat la o mărire mică.

Pentru diagnostic diferentiat larve filariforme, trebuie să utilizați datele din tabelul 3.

Tabelul 3

DIAGNOSTIC DIFERENȚIAL AL ​​LARVELOR FILARIATE DE A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

larvele	Dimensiuni	Trasaturi caracteristice
A. duodenale	Lungimea corpului aproximativ 660 microni, capac - 720 nm	Striația calotei este mai puțin pronunțată, proeminența gurii este mai puțin vizibilă, capătul anterior al corpului (dar nu și capacul) este tocit, diametrul tubului intestinal este mai mic decât bulbul esofagian, capătul caudal este tocit.
N. americanus	Lungimea corpului aproximativ 590 μm, capac - 660 nm	Teaca este vizibil striată, mai ales în partea caudală a corpului, gura apare întunecată, capătul anterior al corpului (dar nu teaca) este rotunjit ca un capăt îngust. ou de gaina, partea anterioară a tubului intestinal cu un diametru precum bulbul esofagului, capătul cozii este ascuțit ascuțit
S. stercoralis	Lungimea corpului aproximativ 500 µm	Larvă fără teacă, esofagul are aproximativ jumătate din lungimea corpului, coada este tocită sau ramificată
Trichostrongylus sp.	Lungimea corpului aproximativ 750 microni	Lumenul intestinal nu este drept, ci în zig-zag, capătul caudal este rotunjit și are forma unui nasture

7.7.2. Metode de colorare a ouălor și a larvelor de helminți

Țesuturile moarte în majoritatea cazurilor percep culorile mai repede decât cele vii. Aceste caracteristici sunt utilizate în helmintologie pentru a determina viabilitatea ouălor și a larvelor de helminți. Cu toate acestea, în unele cazuri, unele vopsele sunt mai bine percepute de țesuturile vii decât de cele moarte.

Pentru determinarea diferențială a ouălor și larvelor vii și moarte, se folosesc următoarele vopsele și metode.

Leucobaza albastru de metilen este adesea folosită pentru a colora țesuturile vii și moarte. celula vie sau țesutul reduce albastrul de metilen la o leucobază incoloră, țesutul mort nu are această capacitate și prin urmare capătă culoare.

Criteriul pentru starea oului este colorarea embrionului, dar nu a cochiliei. Această abilitate este legată de condițiile morții ouălor. În acele cazuri în care coaja fibroasă din oul mort nu își pierde proprietățile semi-permeabile, nu va trece coloranți, prin urmare, embrionul mort nu va fi pătat. Un embrion colorat indică întotdeauna moartea oului.

Pentru colorarea ouălor Ascaris, puteți folosi albastru de metilen într-o soluție de acid lactic cu alcali caustic (albastru de metilen 0,05 g, sodă caustică 0,5 g, acid lactic - 15 ml). Ouăle vii nu percep culoarea; sunt pictate în culoarea albastra embrioni de ouă moarte. Larvele de Ascaris sunt colorate cu o soluție bazică de vopsea albastru cresyl-brilliant la o concentrație de 1: 10.000. în felul următor: o picătură de lichid cu ouă de ascaris și o picătură din soluția principală de vopsea se aplică pe o lamă de sticlă. Preparatul este acoperit cu o lamelă, care este apăsată strâns pe lama de sticlă cu o lovitură ușoară cu un ac de disecție. La microscop se observă numărul de larve eclozate și gradul de colorare a acestora; după care același medicament este revizuit din nou după 2 până la 3 ore. Numai larvele neformate care nu s-au colorat timp de 2 ore sunt considerate vii. Larvele moarte fie nu ies din ouă, fie se patează atunci când coaja se rupe (parțial sau complet).

Atunci când se determină viabilitatea ouălor de ascaridia păsărilor, este posibil să se coloreze preparatele cu o soluție alcoolică de iod de 5%. Când se aplică medicamentului, embrionii de ouă de ascarid moarte timp de 1 - 3 secunde. sunt vopsite portocaliu.

Ouăle moarte de opistorhis și oncosferele de tenie bovină sunt colorate cu o soluție de albastru de toluidină (1:1000), iar oncosferele moarte de tenia bovină sunt colorate cu o soluție de albastru-cresil strălucitor (1:10000). În același timp, embrionii și cojile ouălor morți și vii capătă culoare. Prin urmare, după colorare, ouăle și oncosferele sunt spălate apă curatăși apoi colorați-le cu safranină (într-o diluție de alcool 1:10.000 la 10 ° C). Alcoolul îndepărtează vopseaua de pe cochilii, iar safranina pătează roșu. Ca rezultat, ouăle vii devin roșii; ouă cu embrioni morți - în albastru, iar coaja rămâne roșie. Embrionii morți ai oncosferelor tenia de bovine devin rapid, în câteva minute, roșu aprins sau culoarea roz safranină sau albastru-cresyl-brilliant albastru la o diluție de 1:4000 sau indigo carmin la o diluție de 1:1000 - 1:2000. Embrionii vii nu se schimba sub influenta acestor culori nici dupa 2 - 7 ore.

Pentru a determina viabilitatea ouălor de tenia pigmei, se recomandă utilizarea următoarelor vopsele:

1. Albastru de creasyl strălucitor (1:8000) - după 1 oră, oncosfera ouălor moarte este deosebit de viu colorată, care iese în evidență puternic pe fundalul pal sau incolor al restului oului.

2. Safranină (1:8000 timp de 2 ore și 1:5000 timp de 3 până la 5 ore).

3. Soluție 50% de acid pirogalic într-o diluție 1:2 - atunci când este expus timp de 1 oră la o temperatură de 29 - 30 ° C (cu cât temperatura este mai mică, cu atât procesul de colorare este mai lung).

7.7.3. Metodă luminiscentă pentru studiul ouălor și larvelor de helminți

Microscopia luminescentă face posibilă diferențierea obiectelor vii și moarte fără a deteriora oul. Pentru fluorescență nu se folosesc razele ultraviolete, ci partea albastru-violetă a luminii vizibile, cu microscop convențional și lame de sticlă; un set special de filtre de culoare este adăugat la iluminatorul OI-18.

Ouăle vii și moarte ale viermilor rotunzi, oxiurilor, teniei pigmei, teniei bovinelor, teniei și alți helminți luminesc diferit. Acest fenomen se observă atât în ​​timpul luminiscenței primare fără utilizarea coloranților, cât și atunci când se colorează cu fluorocromi (acridină portocalie, corifosfină, primulină, aurolină, sulfat de berlerina, tripaflavină, rivanol, quinacrin etc.).

Ouăle de viermi rotunzi vii, nesegmentate, nepătate, strălucesc în verde strălucitor cu o nuanță gălbuie; în ouăle moarte, coaja emite lumină verde mult mai strălucitoare decât partea embrionară verde închis; la ouăle de viermi rotunzi cu o larvă apare doar coaja, în timp ce la morți atât coaja, cât și larva sunt galbene strălucitoare.

Ouăle vii nepigmentate și nesegmentate de oxiuri și tenii pitici emit o lumină galben-verzuie; în ouăle moarte, coaja luminesce intens pe fundalul unei mase embrionare de culoare verde închis.

Cu luminiscență secundară (atunci când colorați portocaliu de acridină la o diluție de 1:10000 și 1:50000 de la 30 de minute la 2 ore), coaja nematodelor, trematodelor și cestodelor vii și morți luminesce diferit.

Coaja ouălor vii și moarte ale ascaridelor, toxocarului, oxiurilor, teniei pigmei, teniei de șobolan, teniei taurului, teniei devine portocaliu-roșu. Embrionii ouălor vii de ascaris, toxascaris, teniei de șobolan, teniei late și oncosferei de teniei bovine luminesc într-o culoare terasă verde închis sau gri-verde. Embrionii morți ai ouălor acestor helminți emit o culoare roșu-portocalie „arzătoare”. Larvele vii de oxiuri și toxocars (coji de ouă) emit o lumină surprinsă de culoare gri-verde, când mor, culoarea se schimbă de la capătul capului la un verde deschis „arzător”, apoi galben, portocaliu și în final la portocaliu strălucitor.

Când sunt colorate cu fluorocromi - coryphosphyllum, primulina, ouăle moarte de ascaride și tricocemii arată o strălucire de la galben-liliac la roșu-cupru. Ouăle viabile nu luminesc, ci sunt colorate culoare verde închis.

Ouăle vii ale trematodelor (Paragonimus și Clonorchis) nu luminesc după colorarea cu portocaliu de acridină, iar o culoare verde-gălbuie provine din ouăle moarte.

Metoda luminiscenței poate fi folosită și pentru a determina viabilitatea larvelor de helminți. Deci, fluorocromizat cu o soluție de acridină portocalie (1: 2000) larve de strongilat, strălucire rhabdita: viu - verde (cu o tentă), mort - lumină portocalie strălucitoare.

Miracidiile vii care ies din cochilie emit o lumină slabă albăstruie cu o corolă galben deschis a cililor abia vizibilă, dar la 10-15 minute după moarte ele apar ca o lumină verde deschis „arzătoare” și apoi lumină portocalie-roșie.

7.7.4. metoda de analiză biologică

De exemplu, pentru a determina viabilitatea ouălor de ascaris (porci ascaris, oameni, toxocara, toxascaris etc.) per animal (cobai, șoareci), sunt necesare cel puțin 100 - 300 de ouă cu o larvă dezvoltată. Ouăle de Ascaris în soluție izotonă de clorură de sodiu sunt pipetate prin gura unui șoarece sau cobai. După 6-7 zile, animalul este sacrificat, deschis și ficatul și plămânii lui sunt examinați separat pentru prezența larvelor de ascaris. Pentru a face acest lucru, ficatul și plămânii sunt tăiați în bucăți mici cu foarfece și examinați conform metodei Berman sau Supryaga (secțiunea 6.1.2).

Dacă animalele au fost infectate cu ouă invazive vii, atunci la autopsie în ficat și plămâni se găsesc larve migratoare de ascaris.

În caz de infecție, ouăle de Fasciola din fecalele animalelor de laborator pot fi detectate la iepuri după 2 luni, în porcușori de Guineea- după 50 de zile, la șoareci - după 35 - 40 de zile.

Pentru un răspuns mai rapid, animalele de laborator sunt deschise după 20-30 de zile și ficatul este examinat pentru prezența fasciolilor tineri.

Pentru a determina viabilitatea ouălor de tenie pigmee, se recomandă, de asemenea, hrănirea acestora la șoareci albi neinfectați anterior, urmată de autopsia animalelor după 92-96 de ore și depistarea cisticercoizilor în vilozitățile intestinale sau cestodele din lumenul intestinal.

Pentru a determina viabilitatea ouălor de opistorhis se recomandă o metodă (German S.M., Beer S.A., 1984), bazată pe activarea fizico-chimică a glandei de ecloziune miracidium și stimularea activitate motorie larve, ceea ce duce la deschiderea capacului oului și eliberarea activă de miracidiu în condiții experimentale.

O suspensie de ouă de opistorhis în apă este prerăcită la 10 - 12 ° C (toate operațiunile ulterioare se efectuează la temperatura camerei 19 - 20 °C). 1 picătură dintr-o suspensie care conține 100-150 de ouă se adaugă într-un tub de centrifugă. Eprubeta se pune într-un trepied timp de 5-10 minute. În acest timp, toate ouăle au timp să se scufunde în fund. Apoi, cu o bandă de hârtie de filtru, excesul de apă este aspirat cu grijă și se adaugă 2 picături dintr-un mediu special în eprubetă. Mediul este preparat în tampon Tris-HCI 0,005 M; Se adaugă în tampon 12 - 13% soluție de etanol și colorant (magenta, safranină, eozină, albastru de metilen etc.). Eprubeta este agitată, conținutul său este transferat cu o pipetă pe o lamă de sticlă și lăsat timp de 10 minute, agitând ușor. Apoi adăugați 2 picături din mediul indicat. Preparatul este gata pentru microscopie sub un microscop cu lumină convențional la o mărire de 20x.

În acest timp, capacul larvelor viabile se deschide, iar miracidiul intră activ în mediul indicat. Datorită prezenței etanolului în el, acestea sunt imobilizate după 2-5 minute și apoi colorate cu un colorant. Ele pot fi ușor detectate și numărate la microscopie.

Cel mai adesea, infecția cu helminți apare prin alimente contaminate, apă și, de asemenea, prin mâinile nespălate.

Metode directe și indirecte de diagnosticare a helmintiazelor

Până în prezent, au fost dezvoltate multe metode diagnostice helmintiazele, dar toate pot fi împărțite în două mari grupuri: directe și indirecte. Metodele de diagnostic direct includ acele studii care vă permit să identificați direct helminții, fragmentele lor, larvele sau ouăle. Metodele indirecte de diagnosticare a helmintiazelor se bazează pe identificarea modificărilor secundare caracteristice unei anumite varietăți de helmintiază.

Cele mai populare metode directe de diagnosticare a helmintiazelor sunt metodele de cercetare macro- și microhelmintoscopică.

Metode de cercetare macrohelmintoscopică

Întrebări de la cititori

18 octombrie 2013, ora 17:25 Buna ziua. Mă mâncărime de aproape un an anus. Nici unul durere. Spune-mi pe cine să mă adresez și ce ar putea fi? Mulțumiri

Pune o intrebare

Metode de cercetare în microhelmintoscopie

Metode de cercetare imunologică

Diagnosticul helmintiazelor se bazează pe detectarea anticorpilor specifici la anumiți helminți în serul sanguin. Pentru studiile imunologice se utilizează metoda hemaglutinării indirecte, imunotestul enzimatic, imunoelectroforeză, imunoabsorbție și altele metode serologice studii de sânge.

Metodele de cercetare imunologică sunt utilizate pentru diagnosticarea alveococozei, echinococozei, cisticercozei, ascariazei, schistosomiazei și a altor helmintiază.

Analiza conținutului biliar și duodenal

Biopsie

Diagnosticarea electropuncturii

Diagnosticul prin electropunctură se bazează pe analiza rezistenței pielii atunci când este iritată de slaba sa soc electric. Diagnosticul prin electropunctură pentru suspiciunea de helmintiază poate fi efectuat în două moduri: prin metoda Voll sau prin testarea rezonanței.

Metode instrumentale de cercetare

Cu helmintiază, se efectuează și procedura cu ultrasunete, FEDGS și diagnosticare computerizată. Aceste metode vă permit să determinați gradul de vătămare cauzată de helminți, precum și să determinați starea organelor individuale.

Când ouăle de helminți se găsesc pe diverse obiecte de mediu (sol, apă, legume etc.), este întotdeauna necesar să se determine viabilitatea lor prin aspect, colorarea cu coloranți vitali, cultivarea în condiții optime și constituirea unei probe biologice, i.e.

Hrănirea animalelor de laborator.

Determinarea viabilității ouălor sau larvelor de helminți în aspect. Ouăle de helminți sunt microscopate mai întâi la mărire mică, apoi la mărire mare. În ouăle deformate și moarte ale helminților, coaja este ruptă sau îndoită spre interior, plasma este tulbure, slăbită. În ouăle segmentate, bilele de clivaj (blastomerii) sunt inegale ca mărime, formă neregulată și adesea mutate la un singur pol. Uneori există ouă anormale, care, având deformări externe, se dezvoltă normal. La larvele vii de ascaride, granularitatea fină este prezentă doar în partea de mijloc a corpului, pe măsură ce acestea mor, granularitatea se răspândește în tot corpul, apar vacuole mari hialine strălucitoare - așa-numitele șiruri de perle.

Pentru a determina viabilitatea ouălor mature de ascaride, viermi bici, oxiuri, mișcările active ale larvelor ar trebui să fie cauzate de încălzirea ușoară a preparatului (la o temperatură care nu depășește 37 ° C). Este mai convenabil să se observe viabilitatea larvelor de ascaris și tricoceluș după ce acestea sunt izolate din coaja ouălor prin apăsarea pe paharul preparatului cu un ac de disecție sau o pensetă.

La larvele invazive de ascaride, se observă adesea un capac care s-a exfoliat la capătul capului, iar la larvele de viermi bici care și-au finalizat dezvoltarea în ou, se găsește un stilt în acest loc la mărire mare. La larvele moarte de helminți, indiferent de locația lor (în ou sau în afara acestuia), se observă degradarea corpului. În acest caz, structura internă a larvei devine noduloasă sau granulară, iar corpul devine tulbure și opac. Vacuolele se găsesc în corp, iar rupturi se găsesc pe cuticulă.

Viabilitatea oncosferelor teniide (tenii bovine, porcine etc.) este determinată de mișcarea embrionilor atunci când sunt expuși la enzimele digestive. Ouăle se pun pe un pahar de ceas cu suc gastric de câine sau suc duodenal artificial. Compoziția acestuia din urmă: pancreatina 0,5 g, bicarbonat de sodiu 0,09 g, apă distilată 5 ml. Paharele de ceas cu ouă se pun într-un termostat la 36-38 ° C timp de 4 ore. În acest caz, embrionii vii sunt eliberați din cochilii. Învelișurile oncosferelor vii se dizolvă și în pepsină acidulată și într-o soluție alcalină de tripsină după 6-8 ore într-un termostat la 38°C.

Dacă ouăle de teniid sunt plasate într-o soluție de 1% de sulfură de sodiu, sau o soluție de 20% de hipoclorură de sodiu, sau într-o soluție de 1% apă cu clor la 36-38 ° C, embrionii maturi și vii sunt eliberați din membrane și nu nu se schimba timp de 1 zi. Oncosferele imature și moarte se zboară sau se umflă și cresc brusc, apoi se „dizolvă” în 10 minute - 2 ore. De asemenea, embrionii vii de teniide se mișcă activ într-un amestec de soluție de clorură de sodiu 1%, soluție de bicarbonat de sodiu 0,5% și bilă la 36- 38 °C.

Viabilitatea echinococilor scolex este determinată cu încălzire scăzută. Pentru a face acest lucru, scolexurile sau capsulele de pui spălate în apă sunt plasate într-o picătură de apă pe o lamă de sticlă cu o gaură, acoperite cu o lamă și examinate la microscop cu o etapă de încălzire la o temperatură de 38-39 ° C. Dacă nu există masă de încălzire, preparatul este încălzit folosind orice sursă de căldură. În același timp, scolexurile viabile se mișcă în mod activ, reducând sau relaxând ventuzele, lungind și scurtând proboscisul. Dacă plasați scolex în 0,5-1% soluție de apă filicilene la temperatura camerei, atunci toate scolexurile viabile se vor dovedi rapid și vor muri. Scolexurile neviabile nu se dovedesc.

Viabilitatea fascioliei adolescariae colectate din plante și alte obiecte ale corpurilor de apă este verificată prin examinarea lor pe o lamă de sticlă în soluție salină la microscop cu o etapă de încălzire. Când sunt încălzite, larvele trematode din chist încep să se miște.

Viabilitatea ouălor teniei pitic este determinată de locația cârligelor pe embrion.

În ouăle vii ale teniei pigmei, au loc mișcări lente, asemănătoare pendulului, ale protoplasmei și prelungiri și deplasări aproape imperceptibile ale capetelor ascuțite ale perechii laterale de cârlige departe de perechea de mijloc.

Contracțiile protoplasmei embrionului și cârligele germinale ajută embrionul să se elibereze mai întâi de cochiliile oncosferei și apoi de înveliș exterior ouă.

Într-un ou viu, perechea mediană și perechile laterale de cârlige sunt dispuse în paralel; la unele ouă, lamele perechilor laterale sunt reunite și situate la un unghi mai mic de 45° față de perechea de mijloc de cârlige.

Embrionul pe moarte se contractă convulsiv și împinge încet cârligele. La embrionul mort, mișcarea cârligelor se oprește, iar acestea sunt dispuse într-o dezordine, uneori cârligele laterale de perechea vecină sunt depărtate în unghi drept, obtuz sau acut.

Uneori se observă șifonarea embrionului, formarea granularității. O metodă mai precisă se bazează pe apariția mișcărilor oncosferei în timpul unei schimbări bruște a temperaturii: de la 5-10 la 38-40 °C.

Determinarea viabilității nematodelor imature trebuie studiată într-o cameră umedă (cube Petri), plasând ouăle de ascaris într-o soluție de formol 3% preparată într-o soluție izotonă de clorură de sodiu la o temperatură de 24-30 ° C, ouăle de vierme într-o 3% soluție de acid clorhidric la o temperatură de 30-35 °C, ouă de oxiuri în soluție izotonică de clorură de sodiu la o temperatură de 37 °C. Vasele Petri trebuie deschise de 1-3 ori pe săptămână pentru o mai bună aerare și umeziți din nou hârtia de filtru cu apă curată.

Observațiile dezvoltării ouălor de helminți se efectuează de cel puțin 2 ori pe săptămână. Absența semnelor de dezvoltare în 2-3 luni indică non-viabilitatea acestora. Semnele dezvoltării ouălor de helminți sunt mai întâi etapele zdrobirii, împărțirea conținutului oului în blastomeri separate. În prima zi se dezvoltă până la 16 blastomeri, care trec în a doua etapă - morula etc.

Ouăle de anchilostoma se cultivă într-un cilindru de sticlă (50 cm înălțime și 7 cm în diametru) închis cu dop. Un amestec de volume egale de nisip steril, cărbune și fecale cu ouă de vierme, diluat cu apă până la o consistență semi-lichidă, se toarnă cu grijă în fundul cilindrului folosind un tub de sticlă. În timpul a 1-2 zile de așezare în întuneric la o temperatură de 25-30 ° C, larvele rabditoide eclozează din ouă, iar după 5-7 zile devin deja filariforme: larvele se târăsc pe pereții cilindrului, unde sunt vizibile chiar și cu ochiul liber. Ouăle de trematode care se dezvoltă în mod natural în apă, cum ar fi opistorhisul, difilobotriidul, fasciolul etc., sunt așezate pe un pahar de ceas, o placă Petri sau într-un alt vas, se toarnă un mic strat de apă obișnuită. La cultivarea ouălor de fasciola, trebuie luat în considerare faptul că acestea se dezvoltă mai repede în întuneric, în timp ce miracidiumul se formează în ouăle vii la o temperatură de 22-24 ° C în 9-12 zile. La microscopia ouălor trematode în curs de dezvoltare, mișcările miracidium sunt clar vizibile. Fasciola miracidium iese din cojile ouă doar la lumină. La cultivare apa se schimba dupa 2-3 zile.

Larvele de anchilostoma și strongiloidul sunt cultivate pe agar într-o cutie Petri cu cărbune animal. După ce au stat într-un termostat la o temperatură de 26-30°C timp de 5-6 zile, larvele s-au răspândit peste agar, lăsând în urmă o cale de bacterii (metoda Fülleborn).

Metoda lui Harada și Mori (1955). Se adaugă 7 ml apă distilată în eprubete plasate într-un suport. Luați 0,5 g de fecale cu un băț de lemn și faceți un frotiu pe hârtie de filtru (15X150 mm) la 5 cm de marginea stângă (această operațiune se efectuează pe o foaie de hârtie pentru a proteja suprafața mesei de laborator). Apoi banda cu frotiu este introdusă în tub, astfel încât capătul stâng liber de frotiu să ajungă la fundul tubului. Capătul superior este acoperit cu o bucată de celofan și strâns înfășurat cu o bandă elastică. Pe eprubetă scrieți numărul și prenumele subiectului. În această stare, tuburile se păstrează timp de 8-10 zile la o temperatură de 28 °C. Pentru a studia cultura, scoateți și îndepărtați capacul din celofan și îndepărtați o bandă de hârtie de filtru cu penseta. Trebuie avut grijă în acest caz, deoarece un număr mic de larve infecțioase se pot deplasa la capătul superior al hârtiei de filtru sau pe peretele eprubetei și poate pătrunde sub suprafața celofanului.

Tuburile sunt plasate într-o baie de apă fierbinte la 50°C timp de 15 minute, după care conținutul este agitat și turnat rapid într-un tub de 15 ml pentru a precipita larvele. După centrifugare, supernatantul este îndepărtat, iar precipitatul este transferat pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamelă și microscopat la o mărire mică.

Pentru diagnosticul diferențial al larvelor filariforme, este necesar să se utilizeze datele prezentate în tabel. treisprezece.

Metode de colorare a ouălor și a larvelor de helminți. Țesuturile moarte în majoritatea cazurilor percep culorile mai repede decât cele vii. Aceste caracteristici sunt utilizate în helmintologie pentru a determina viabilitatea ouălor și a larvelor de helminți. Cu toate acestea, în unele cazuri, unele vopsele sunt mai bine percepute de țesuturile vii decât de cele moarte.

Tabelul 13 Diagnostic diferentiat larve filamentoase de A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Pentru recunoașterea diferențială a ouălor și larvelor vii și moarte, se folosesc următoarele vopsele și metode.

Leucobaza albastru de metilen este folosită pentru colorarea țesuturilor vii și moarte. O celulă sau un țesut viu reduce albastrul de metilen la o leucobază incoloră; țesutul mort nu are această capacitate și, prin urmare, capătă o culoare.

Pentru colorarea ouălor Ascaris, puteți folosi albastru de metilen într-o soluție de acid lactic cu alcali caustic (albastru de metilen 0,05 g, sodă caustică 0,5 g, acid lactic 15 ml). Ouăle vii nu percep culoarea, embrionii ouălor moarte devin albaștri.

Metoda de colorare nu este aplicabilă ouălor imature de viermi rotuși și tricoceluși; coaja pigmentată se pătează și, prin urmare, nu este vizibil dacă celula germinativă din interiorul oului s-a colorat.

Larvele de Ascaris sunt colorate cu o soluție de bază de vopsea albastru cresyl-brilliant la o concentrație de 1:10 000, după cum urmează: o picătură de lichid cu ouă de ascaris și o picătură de soluție de vopsea de bază se aplică pe o lamă de sticlă. Preparatul este acoperit cu o lametă, care este presată strâns pe obiect, cu o lovitură ușoară cu un ac de disecție. La microscop se observă numărul de larve eclozate și gradul de colorare a acestora, după care se examinează din nou același preparat după 2-3 ore.Se consideră vii doar larvele neformate care nu s-au colorat timp de 2 ore.Larvele moarte se colorează atunci când coaja se rupe (parțial sau complet).

Este indicată posibilitatea colorării preparatelor cu soluție de iod în determinarea viabilității ouălor păsărilor de ascaridia. În acest caz, 5% este folosit ca colorant. soluție alcoolică iod. Când este aplicat medicamentului, embrionii ouălor moarte de ascarid devin portocalii în 1-3 secunde. Ouăle moarte de opistorhis și oncosferele de tenia bovină sunt colorate cu o soluție de albastru de toluidină (1:1000), iar oncosferele moarte de tenia bovină sunt colorate cu o soluție de albastru cresyl-brilliant (1:10.000). În același timp, embrionii și cojile ouălor morți și vii capătă culoare. Prin urmare, după colorare, ouăle și oncosferele se spală în apă pură și se colorează suplimentar cu safranină (diluată 1:10.000 cu o soluție de alcool 10%). Alcoolul îndepărtează vopseaua de pe coji, iar safranina le dă o culoare roșie. Drept urmare, ouăle vii sunt colorate în roșu, embrionul ouălor moarte este albastru, iar coaja rămâne roșie. Embrionii morți ai oncosferelor de tenia bovină sunt colorați rapid, în câteva minute, în roșu aprins sau roz cu safranină sau albastru cu diamant-cresyl albastru la o diluție de 1:4000 sau cu indigo carmin la o diluție de 1:1000-1: 2000.

Embrionii vii nu se schimba sub influenta acestor culori nici dupa 2-7 ore.

Pentru a determina viabilitatea ouălor de teniei pigmei, se recomandă utilizarea următoarelor vopsele: 1) albastru cresyl strălucitor (1: 8000) - după 1 oră, oncosfera ouălor moarte este deosebit de viu colorată, care se evidențiază puternic pe un palid. sau fond incolor al restului de ou; 2) safranină: la o diluție de 1:8000 când este expus timp de 2 ore și 1:5000 timp de 3-5 ore; 3) Soluție 50% de acid pirogalic la o diluție de 1:2 - atunci când este expus timp de 1 oră la o temperatură de 29-30 ° C (cu cât temperatura este mai mică, cu atât procesul de colorare este mai lung).

Plerocercoizii vii ai teniei late sunt foarte bine colorați cu o soluție apoasă (1:1000) de gură neutră timp de 5-20 de minute. Pentru a obține o culoare roz persistentă care să nu dispară în 5 zile și să nu afecteze mobilitatea plerocercoizilor, de obicei sunt suficiente 10 minute. Gradul de culoare este controlat prin vizualizarea larvelor în soluție izotonică pură de clorură de sodiu, pentru care plerocercoizii sunt îndepărtați periodic din vopsea. Este recomandabil să folosiți albastru de metilen pentru a colora plerocercoizii morți.

R.E. Chobanov și colab.(1986) au propus o metodă pentru determinarea viabilității ouălor și larvelor de helminți folosind pigmentul rubrin obținut prin cultivarea ciupercii Peniciliium rubrum ca colorant. Pentru a face acest lucru, utilizați o soluție apoasă de colorant 3%.

Procesul de colorare a ouălor și a larvelor se finalizează după 1,5 ore.Ouăle neviabile de oxiuri, tenii bovine și pitice, anchilostomide, tricostrongilide capătă o culoare roz intens, larvele de anchilostomide și tricostrongilide devin roșii. O culoare mai puțin strălucitoare se observă în ouăle de ascaris și vierme, deoarece, ieșind în evidență din intestine, au deja culoare maro închis: Ouăle și larvele viabile nu se pătează.

Metode fizico-chimice de stimulare a eliberării miracdiilor din ouăle de trematode. Metodele au fost dezvoltate de S.M. German și S.A. Beer (1984) pentru a determina viabilitatea ouălor de opistorhie și dicroceliu prin expunerea ouălor la mediul de reacție. Dacă sunt în viață, iese miracidium. Metodele se bazează pe activarea fizico-chimică a glandei de ecloziune miracidium și stimularea activității motorii a larvei. Stimularea se realizează prin expunerea ouălor de trematode la un mediu de reacție special în combinație cu metode succesive - crearea unei diferențe de temperatură, uscarea suspensiei de ouă, expunerea la un flux slab de lichid în picătura de testare, care contribuie la eliberarea în masă a miracidiei din ouă.

Determinarea viabilității ouălor de opistorcă prin metoda lui Herman, Beer. O suspensie de ouă în apă (robinet, decantat) este prerăcită la 10-12 ° C. Toate operațiunile ulterioare se efectuează la temperatura camerei (18-22 °C). O picătură (aproximativ 0,05 ml) dintr-o suspensie care conține 100-400 de ouă este adăugată într-un tub de centrifugă. Eprubetele se pun intr-un gratar timp de 5-10 minute pentru a precipita ouale. Apoi, cu o fâșie îngustă de hârtie de filtru, excesul de apă este aspirat cu grijă până când este complet îndepărtat. Se adaugă 2 picături de mediu în eprubetă, se agită, conținutul se transferă cu o pipetă pe o lamă de sticlă și se lasă timp de 5-10 minute, agitând ușor (sau plasat sub uscător de păr) pentru a crea curenti slabi de lichid în scăderea suspensiei în studiu. Această operație, care imită peristaltismul intestinal al unei moluște, vă permite să activați eliberarea miracidiei. După aceea, în suspensie se adaugă încă 2 picături de mediu, apoi preparatul este examinat microscopic folosind un microscop cu lumină convențională (X200). În acest timp, ouăle cu miracidie viabile ar trebui să deschidă capacul, în timp ce larva iese activ în mediu. Datorită prezenței etanolului în el, miracidiul este imobilizat în 3-5 minute și apoi colorat cu un colorant în mediu. Ca urmare, miracidia sunt ușor de detectat și numărat.

Prepararea mediului de reacție. Mediul este preparat în tampon Tris-HCi 0,05 M în condiții optime de pH de 8,0-9,5. Etanol este adăugat în tampon până la 10-13% și un colorant (safranină, albastru de metilen și altele care lucrează în intervalul de pH) până când lichidul este ușor colorat (de exemplu, pentru safranină concentrația sa finală va fi de 1:50.000). Puteți utiliza un alt tampon care funcționează în intervalul de pH alcalin, cum ar fi fosfat 0,05 M (pH 8,5). Prin urmare, mediul conține 96% etanol - 12 părți; colorant (soluție mamă) - 1-10 părți; 0,05 M tris-HC! tampon (pH 8,5-9,5) - până la 100 părți. Exemplu mediu: 12 părți etanol 96%, 1 parte soluție saturată de safranină, restul până la 100 părți - tampon Tris-HCl 0,05 M, pH 9,5.

Determinarea viabilității ouălor de dicroceliu prin metoda lui Herman, Beer, Stratan. O picătură de suspensie care conține 100-150 de ouă de trematode este plasată într-un tub de centrifugă timp de 1-2 minute pentru a se depune ouăle. Lichidul este apoi uscat cu grijă cu o bandă de hârtie de filtru. Se adaugă 1-2 picături de mediu de reacție cu o pipetă Pasteur și se incubează într-o baie de apă la 28-30 °C timp de 2-3 minute. Compoziția mediului: 6 părți butanol, 94 părți soluție de clorură de sodiu 0,4% sau soluție de clorură de potasiu 0,3% în apă distilată. Ouăle din mediu se transferă cu o pipetă pe o lamă de sticlă și se lasă timp de 1,5-2 ore la temperatura camerei (18-22 ° C), în timp ce la fiecare 25-30 de minute (pe măsură ce se usucă) se adaugă 1-2 picături (0,05). ml) soluție de butanol în apă distilată. După aceea, preparatul este microscopat la o mărire de 100-200 de ori. Viabilitatea este determinată de numărul de ouă deschise cu miracidie eliberate. Butanolul pătrunde prin porii cojii de ou, ajunge la miracidie și le activează. Incubarea la o temperatură marcată îmbunătățește acest proces. Butanolul la o concentrație de 3-7% dăunează miracidiului care a apărut din ou. Transferul unei suspensii de ouă dintr-o eprubetă pe o lamă de sticlă permite, până la ieșirea miracidiului (după 30-40 de minute), reducerea concentrației de butanol din cauza volatilizării la un nivel sigur (1,5-0,5%). Prezența clorurii de sodiu în mediu la o concentrație de 0,1-0,5% (sau a clorurii de potasiu la o concentrație de 0,05-0,4%) determină activitatea miracidiului eliberat. Spre deosebire de ouăle mici și transparente de opistorc, ouăle de dicrocelium au o coajă de culoare închisă; au un capac clar vizibil, care este deschis după eliberarea miracidiului. Prin urmare, viabilitatea ouălor de dicroceliu este mai convenabil evaluată prin numărarea ouălor care s-au deschis, mai degrabă decât prin colorarea și numărarea miracidiei.

Metodă luminiscentă pentru studiul ouălor și larvelor de helminți.

Pentru prima dată în practica helmintologică, metodele de microscopie cu luminiscență au fost aplicate în 1955. S-a raportat că microscopia cu luminiscență face posibilă diferențierea obiectelor vii și moarte fără a deteriora oul. Pentru fluorescență nu s-au folosit razele UV, ci partea albastru-violetă a luminii vizibile, cu un microscop convențional și lame de sticlă; pentru iluminatorul OI-18 a fost folosit un set special de filtre de culoare.

S-a constatat că ouăle vii și moarte de viermi rotunzi, oxiuri, tenii pigmei, tenii bovine, tenii late și alți helminți luminesc diferit. Acest fenomen se observă atât în ​​timpul luminiscenței primare fără utilizarea coloranților, cât și atunci când se colorează cu fluorocromi (acridină portocalie, corifosfină, primulină, aurolină, sulfat de berlerina, tripaflavină, rivanol, quinacrin etc.).

Ouăle de viermi rotunzi vii, nesegmentate, nevopsite, strălucesc în verde strălucitor, cu o nuanță gălbuie; în ouăle moarte, coaja emite lumină verde mult mai strălucitoare decât embrionul verde închis; la ouăle de viermi rotunzi cu o larvă apare doar coaja, în timp ce la morți atât coaja, cât și larva sunt galbene strălucitoare.

Ouăle vii nepigmentate și nesegmentate de oxiuri și tenii pigmei emit o lumină galben-verzuie; în ouăle moarte, coaja luminesce intens pe fundalul unei mase embrionare de culoare verde închis. Cu luminiscență secundară (atunci când este colorată cu portocaliu de acridină la o diluție de 1:10 OOO și 1:50 OOO de la 30 de minute la 2 ore), coaja nematodelor, trematodelor și cestodelor vii și morți luminesce diferit.

Învelișul Ascaris lumbricoides vii și morți, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum devine portocaliu-roșu. Embrioni de Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum și oncosferele teniei bovine luminesc într-o culoare verde închis mac sau gri-verde. Embrionii morți ai acestor ouă de helminți emit o lumină roșie-portocalie „arzătoare”. Larvele vii de oxiuri și toxocars (coji de ouă) emit o lumină surprinsă de culoare gri-verde, iar când mor, culoarea se schimbă de la capătul capului la un verde deschis „arzător”, apoi galben, portocaliu și, în final, portocaliu strălucitor.

Când sunt colorate cu fluorocromi - coryphosphyllum, primulină - în ouăle moarte de ascaride și tricocemii, se observă o strălucire de la galben-liliac la roșu-cupru. Ouăle viabile nu luminesc, ci devin verde închis. Ouăle vii ale trematodelor Paragonimus westermani și Clonorchis sinensis nu luminesc după colorarea cu portocaliu acridină, în timp ce ouăle moarte emit o lumină verde gălbuie.

Metoda luminiscenței poate fi folosită și pentru a determina viabilitatea larvelor de helminți. Deci, fluorocromizat cu o soluție de acridină portocalie (1: 2000) larve de strongilat, strălucire rhabdita: viu - verde (cu o tentă), mort - lumină portocalie strălucitoare. Larvele vii de Trichinella nu strălucesc și nu dau o strălucire slabă atunci când sunt tratate timp de 10 minute cu soluții de izotiocianat de fluoresceină, auramină etc. Larvele moarte fluorocromate (la o concentrație de 1:5000) dau o strălucire strălucitoare.

Miracidiile vii care ies din coajă emit o lumină slabă albăstruie cu o corolă galben deschis a cililor abia vizibilă, dar la 10-15 minute după moarte ele apar ca o lumină strălucitoare „arzătoare” de culoare verde deschis și apoi lumină portocalie-roșie.

Cele mai simple sunt împărțite în 4 clase:

Când este enchistat, microorganismul capătă o formă rotunjită și devine acoperit cu o înveliș protector. Sub formă de chist, protozoarele devin mai puțin sensibile la factorii de mediu negativi.

Cercetarea poate include:

Notă:Există o mulțime de varietăți de diagnosticare, vom lua în considerare acele tipuri care sunt cele mai comune în practica clinică de laborator.

Tipuri private de diagnosticare

În fiecare caz specific, asistentul de laborator are sarcina de a găsi un anumit agent patogen, uneori alții sunt găsiți împreună cu cel principal.

Există 6 specii ale acestui microorganism capabile să trăiască în intestinul uman. Semnificație clinică are doar ameba dizenterică, întâlnită sub formă vegetativă și sub formă de chisturi.

În plus, se folosesc metode imunologice:

• imunofluorescență indirectă;
• aglutinare indirectă (PHA);
• imunodifuzie radială.

Notă: metodele serologice sunt neinformative și sunt folosite doar ca adaos la principalele în cazuri dubioase.

Diagnosticul ciliar (ciliat)

Forma patogenă a microorganismelor din acest gen este balantidia. Acesta este un microb care provoacă balantidiaza - o boală însoțită de un proces ulcerativ al intestinului gros. Agentul cauzal se găsește într-un frotiu nativ sub forma unei forme vegetative și a unui chist. Materialul pentru frotiu (fecale și mucus) este prelevat în timpul unui examen sigmoidoscopic și semănat pe medii speciale.

Diagnosticarea flagelatelor (leishmania, giardia, tripanozomii, trichomonadele)

Leishmania, tripanosomul, giardia, trichomonadele sunt periculoase pentru oameni.

Leishmania- microbi provocând leishmanioză, sunt examinate în frotiuri de sânge, materiale măduvă osoasă, zgârieturi de la infiltrate cutanate. În unele cazuri, în diagnosticul Leishmania se folosește însămânțarea pe medii nutritive.

Tripanozomi– agenți patogeni boala somnului(Tripanosomiaza americană/africană sau boala Chagas).

Varianta africană este determinată în perioada inițială pe parcursul studiului sânge periferic. Microbii patologici în timpul progresiei bolii se găsesc în materialul de puncție a ganglionilor limfatici, în stadii avansate - în lichidul cefalorahidian.

Pentru a diagnostica tripanozomii în caz de suspiciune a bolii Chagas, materialul de testat este examinat la microscop la mărire mică. În acest caz, frotiurile și o picătură groasă sunt pre-pătate.

Trichomonas(intestinale, orale,) sunt detectate prin microscopie a materialelor prelevate din mucoasele afectate.

Identificarea sporozoarelor (plasmodul malaric, agentul cauzal al coccidozei etc.)

Cea mai comună și periculoasă specie pentru oameni este plasmodiumul malaric, care are 4 soiuri principale ale agentului patogen: agentul cauzator al malariei de trei zile, malariei de patru zile, malariei tropicale și malariei ovale.

Dezvoltarea sexuală a Plasmodium (sporogonie) are loc la țânțarii Anopheles. Asexual (schizogonie tisulară și eritrocitară) - în țesutul hepatic și eritrocitele umane. Aceste caracteristici ciclu de viață trebuie luate în considerare în diagnosticul plasmodiului malaric.

Deci, în sângele unui pacient nou bolnav, pot fi găsite celule germinale ale ciclului de sporogonie. Dar la apogeul atacurilor de malarie, schizoții apar în număr mare în sânge.

Mai mult, în diferite faze Febra malaială se manifestă în diferite forme de Plasmodium:

• în perioada de frig, sângele este umplut cu merozoiți, un fel de schizont;
• la înălțimea temperaturii, trofozoiții în formă de inel se acumulează în eritrocite;
• scăderea temperaturii se caracterizează prin predominanța trofozoiților amiboizi;
• pe perioade stare normală sângele conține forme adulte de schizonți.

Studiul agentului cauzal al malariei (plasmodul malaric) se efectuează într-un frotiu și într-o picătură groasă.

Notă:diagnosticul de malarie în studiul frotiurilor și picăturilor groase de sânge este uneori eronat. Trombocitele din sânge în unele cazuri pot fi clasificate în mod eronat ca agent patogen al malariei. De asemenea, fragmentele de leucocite și alte celule simulează uneori plasmodiul.

Metode de cercetare de bază pentru protozoare

Să aruncăm o scurtă privire asupra celor mai comune metode de cercetare pentru prezența protozoarelor.

Diagnosticul protozoarelor folosind un frotiu nativ și un frotiu colorat cu soluție Lugol (în fecale)

Medicamentul este preparat dintr-o emulsie de fecale într-o soluție izotonă. Două picături de clorură de sodiu și soluție Lugol sunt aplicate pe o lamă de sticlă. Materialul de testat este adăugat la ambele compoziții cu un băț de lemn și, după ce a fost acoperit cu sticlă, este vizualizat la diferite rezoluții ale microscopului.

După anumite semne, protozoarele găsite sunt înregistrate. Pentru acuratețe, se prepară 2-3 preparate dintr-un singur material. În cazurile îndoielnice, analiza se repetă de mai multe ori pe parcursul a 2-3 săptămâni.

Metoda poate detecta formele vegetative și chistice:

• lamblia;
• balantidia;
• ameba dizenteriei.

Împreună cu formele patogene se determină și protozoarele nepatogene. Purtătorii sănătoși au și forme luminale și chistice.

Important:cercetarea pentru a evita inexactitățile și erorile ar trebui efectuată în mod repetat.

Rezultatul diagnosticului de protozoare prin metoda unui frotiu nativ și colorat ar trebui să conțină o descriere a formei agentului patogen (translucid, chist, țesut).

Cerinte de cercetare:

• materialul luat pentru analiză (fecale lichide) este examinat nu mai târziu de 30 de minute după defecare;
• fecalele formate trebuie diagnosticate în 2 ore după defecare;
• materialul nu trebuie să conțină impurități ( dezinfectante, apă, urină);
• să lucreze numai cu utilizarea materialului bastoane de lemn, cele de sticlă nu sunt potrivite din cauza alunecării mucusului;
• Bețișoarele trebuie arse imediat după utilizare.

Metoda de conservare (examinarea fecalelor) în diagnosticul protozoarelor

Studiul se realizează prin fixarea protozoarelor cu un conservant. Diferența dintre această metodă și cea anterioară este că conservanții vă permit să păstrați medicamentul pentru o perioadă lungă de timp.

Conservanti folositi:

• Barrow. Conține ingrediente conservante: 0,7 ml clorură de sodiu, 5 ml formol, 12,5 ml alcool 96%, 2 g fenol și 100 ml apă distilată. Compoziție colorantă: 0,01% soluție de tionină (azur).
• Soluția lui Safarliev. Ingrediente: 1,65 g sulfat de zinc, 10 ml formol, 2,5 g fenol cristalin, 5 ml acid acetic, 0,2 g albastru de metilen, 100 ml apă. Acest conservant este utilizat în cazurile în care materialul trebuie păstrat mai mult de o lună.

Sticlele goale sunt umplute cu un conservant, materialul este transferat în ele, în proporții de 3: 1, apoi, dacă este necesar, se adaugă un colorant. Evaluarea rezultatelor se realizează în studiul a 2-3 medicamente.

Metoda de îmbogățire cu formol-eter (analiza prezenței protozoarelor în fecale)

Această metodă de diagnosticare vă permite să separați și să concentrați chisturile protozoare. Pentru analiză sunt necesare următoarele ingrediente: formol (10 ml), 0,85 g soluție izotonă, apă distilată, eter sulfuric, soluție Lugol.

Un amestec de biomaterial cu lichidele enumerate este amestecat și centrifugat. Precipitatul obţinut la fundul tubului se colorează cu soluţie Lugol şi se examinează pentru prezenţa chisturilor şi a formelor vegetative.

Metoda de detectare a Leishmania (frotiu de măduvă osoasă)

Pentru diagnosticarea leishmaniozei se folosesc reactivi: un amestec de Nikiforov (eter sulfuric și etanol), tampon fosfat, Azur-eozin conform Romanovsky.

Substanța măduvei osoase se așează foarte atent pe o lamă de sticlă după antrenament special. Se folosește un microscop cu sistem de imersie.

LA perioada acuta boli la punctate au găsit un număr mare de Leishmania.

Notă:uneori, celulele sanguine pot semăna cu leishmania tratată, așa că este foarte important ca tehnicianul de laborator să fie atent și să aibă suficientă experiență pentru a studia în mod independent.

Metodă de depistare a leishmaniei într-un frotiu dintr-un infiltrat cutanat

Reactivii necesari sunt similari cu testul anterior.

Materialul de testat este obținut din conținutul de tubercul sau ulcerativ existent. Razuirea cu suspiciune de leishmanioza se face foarte atent cu bisturiul, fara sange. Apoi preparatul se prepară pe sticlă. Pentru acuratețea rezultatelor obținute se examinează simultan mai multe preparate.

În prezența unei boli, printre macrofage, fibroblaste și celule limfoide prezente în materialul de testat, se determină și Leishmania.

Metodă de izolare a unei culturi pure de Leishmania obţinută prin răzuirea ţesuturilor patologice

Cu această metodă de diagnosticare cele mai simple răzuire de țesut sunt plasate într-un special mediu nutritiv, în care are loc reproducerea activă a Leishmania.

Înainte de a lua o răzuire, pielea este tratată cu atenție cu alcool, apoi se face o incizie în tubercul, de pe fundul căreia se scoate conținutul și se pune într-o eprubetă cu mediu. Materialul este luat de mai multe ori, după care este pus în diferite eprubete. Apoi, într-un termostat la o temperatură de 22-24 de grade, are loc cultivarea. Rezultatele sunt evaluate la microscop. Această metodă este folosită atunci când altele, mai ieftine și moduri rapide diagnosticul protozoarelor este ineficient.

Puteți vedea cum testele pentru prezența protozoarelor sunt descifrate în practică printr-o picătură de sânge, urmărind o recenzie video:

Lotin Alexander, editorialist medical