Trimiteți-vă munca bună în baza de cunoștințe este simplă. Utilizați formularul de mai jos
Elevii, studenți absolvenți, tineri oameni de știință care folosesc baza de cunoștințe în studiile și munca lor vă vor fi foarte recunoscători.
Postat pe http://www.allbest.ru/
Transferul vectorilor de gene
1. Transferarea genelor la celulele umane și animale cu vectura viralăditch - Principala metodă de terapie genică
În aplicat omului, genoterapia ar putea fi utilizată pentru a trata bolile ereditare. Cu toate acestea, din punct de vedere tehnic, există o diferență semnificativă între tratamentul pacientului însuși și schimbarea genomului descendenților săi.
Sarcina schimbării genomului unui adult este oarecum mai complicată decât eliminarea noilor roci de găină genetic de animale, deoarece în acest caz este necesar să se schimbe genomul numeroaselor celule care au format deja corpul și nu numai ouăle singure numai -embrion. Pentru a face acest lucru, se propune utilizarea particulelor virale ca vector. Particulele virale sunt capabile să pătrundă un procent semnificativ de celule adulte, încorporarea informațiilor lor ereditare în ele; Poate că reproducerea controlată a particulelor virale în organism. În același timp, pentru a reduce efectele secundare, oamenii de știință încearcă să evite introducerea ADN-ului de găină genetică în celulele organelor genitale, evitând astfel impactul asupra descendenților viitori ai pacientului.
Datorită particularităților ciclului de viață al virușilor, primii vectori (purtători ai transgenei) pentru terapia genică au început să se dezvolte tocmai pe ele. Virușii transferă gene străine, care sunt apoi capabile să se exprime în celulele infectate. Un virus simplist poate fi reprezentat ca un acid nucleic ambalat în cochilie. Virusul pătrunde în celula țintă, unde apare expresia genomului viral. Pentru a crea un vector bun, trebuie să schimbați unele proprietăți ale virusului. În majoritatea cazurilor, virusul trebuie privat de posibilitatea de reproducere pentru a preveni distribuția transgene necontrolată. În plus, o parte a genomului viral trebuie îndepărtată pentru a elibera un loc pentru materialul genetic străin. Alte modificări necesare depind de tipul de virus. Vectorii virali sunt utilizați pe scară largă în studiile preclinice și în prezent este tocmai cu cele mai multe studii clinice.
Atunci când alegeți un vector, este necesar să se țină seama de unele caracteristici importante ale ciclului de viață și ale biologiei virusului original. Pentru transfecția de succes este necesar să se asigure infecția electorală a celulelor țintă (Tropiness) și expresia ulterioară a transgenei. Tropalitatea este determinată parțial de prezența unor receptori de membrană specifici care leagă virusul pe suprafața celulară și facilitează pătrunderea în interior. Pentru expresia transgenă, genomul virusului pătrunde în nucleul celular urmat de transcripția și difuzarea de succes. Câțiva factori suplimentari determină durata expresiei transgene într-o celulă infectată. În cele din urmă, caracterul adecvat al virusului ca vector este influențat de unele aspecte metodologice ale ingineriei genei și de obținerea unui vector viral. Principalele vectori virali utilizați acum în studiile clinice sau recunoscute ca promițătoare, sunt create pe baza retrovirusurilor (în special, lentivirus), adenovirusuri, viruși adenoși și un virus simplu de herpes.
Cu ajutorul genoterapiei în viitor, este posibil să se schimbe genomul uman. În prezent, metodele eficiente de schimbare a genomului uman se află în stadiul de dezvoltare și testare a procesului. De mult timp, ingineria genetică a maimuțelor a survenit dificultăți serioase, în 2009, experimentele au fost încoronate cu succes: Revista Nature are o publicație cu privire la utilizarea cu succes a vectorilor virali proiectați genetic pentru vindecarea unei maimuțe de sex masculin adult de la Daltonism. În același an, prima primare modificată genetic (cultivată din ouă modificată) este o jucărie obișnuită.
Deși la scară mică, terapia genetică este deja folosită pentru a oferi o șansă să rămână însărcinată femeilor cu unele varietăți de infertilitate. Pentru a face acest lucru, utilizați ouă o femeie sănătoasă. Copilul ca rezultat crește genotipul de la un tată și două mame.
Cu toate acestea, posibilitatea de a face schimbări mai semnificative în genomul uman se confruntă cu o serie de probleme etice grave.
virus vector genoterapie
2. Tipuri de vectori virali utilizați în terapia genică
1. vectori bazați pe retrovirusuri;
2. vectori bazați pe virușii HIV (lentivirusuri);
3. vectori bazați pe adenovirusuri;
4. vectori bazați pe viruși de adenosoizări;
5. Vectorii bazați pe herpesvirusuri.
Vectorii bazați pe retrovirus
Acestea sunt mici viruși care conțin ARN care pot provoca numai celule de separare în care sunt reproduse. Genomul viral (sub formă de un sutor) este încorporat în ADN-ul celulei țintă. Prin urmare, vectorii retrovirali sunt în mod teoretic capabili să furnizeze o expresie pe termen lung a transgenului în unele tipuri de celule. Majoritatea vectorilor retrovirali sunt obținuți pe baza virusului de leucoză pe șoareci Molon. Gena de virus este schimbată astfel încât să se evite exprimarea proteinelor virale în celulele infectate, ceea ce previne dezvoltarea unui răspuns imun împotriva acestor celule. Deoarece acești viruși infectează numai celulele divizate, vectorii retrovirali sunt utilizați în principal la transfecția celulelor ex vivo sau pentru tratamentul experimental al neoplasmelor maligne.
Ciclu de viață . Genomul retrovirusurilor constă în ARN de lanțuri Plus. Carcasa retrovirus este formată dintr-o membrană celulară infectată și conține proteine \u200b\u200bvirale. Pentru replicarea genomului și a asamblarea virușilor, sunt necesare trei gene virale - gag, pol și env. În celula infectată prin transcriere inversă pe matricea ARN-ului viral, formarea de ADN cu două catene (regimente), care este apoi încorporată în genomul celular. Aceasta oferă proteine \u200b\u200bvirale - revers transcriptază și integrare. Pentru a pătrunde în provirus în miez, distrugerea carcasei nucleare a celulei are loc în timpul mitozei. Provirus utilizat la celula celulară utilizează aparatul celular pentru transcripția magniturilor virale, prelucrarea și emisiunile lor. Ciclul de viață al virusului este completat cu sinteza unor circuite ARN noi plus pe matricea provizioasă. Secvența specifică din moleculele ARN (PSI) dă semnalul de asamblare, după care noii viruși sunt buni de pe suprafața celulară.
Folosind un vector retroviral. A. Schema vectorului retroviral. B. Exprimarea transgenului în celula țintă după introducerea vectorului retroviral conținând ARN
Descriere la figura 1.DAR. Sistem Obținerea unui vector retroviral. Pentru a obține vectori retrovirali care nu sunt capabili de reproducere, liniile de celule speciale pot sintetiza acele proteine \u200b\u200bde virus care sunt îndepărtate la proiectarea unui vector. În celulele unei linii adecvate (de exemplu, celulele embrionare la rinichi umane) cu plasmide bacteriene administrează GAG (G), POL (P) și ENV (E). Celulele care sintetizează proteinele virale corespunzătoare se numesc ambalaje. Plasmida conținând ADN-ul recombinant al provirului, în care, în loc de GAG, POL și EN, transgenul dorit este utilizat pentru a transfecta celulele de ambalare. Acum, celulele conțin tot ce trebuie să construiască viruși, iar vectorii retrovirali încep să se acumuleze în mediul de cultură. Acești vectori conțin o transgenă, dar sunt lipsiți de genele de virusuri gag, pol și env, și, prin urmare, atunci când infectează următoarea celulă, ele nu pot fi reproduse.B. Expresie Transgenă în celula țintă după introducerea unui vector retroviral conținând ARN.
Proiectarea și primirea vectorului. Vectorii retrovirali sunt obținuți din furnizarea corespunzătoare. Gag, Pol și en Genele sunt îndepărtate pentru a elibera un loc pentru un nou material genetic și pentru a împiedica reproducerea virusului (figura 1). Până la 8.000 de nucleotide de ADN străin pot fi incluse în vectorul retroviral. Deoarece virusul recombinant nu poate sintetiza ARNm viral, atunci nu există nicio sinteză a proteinelor virale în celulele transfectate care ar putea cauza un răspuns imun. Împreună cu gena destinată tratamentului, vectorul poate fi introdus promotor și enhan-sam, oferind o expresie eficientă a transgenei și, în unele cazuri, specificitatea țesutului său. De asemenea, puteți utiliza un promotor viral și un amplificator situat în câmpul de repetări terminale lungi (LTR).
După îndepărtarea genelor care codifică proteinele virale și furnizarea de reproducere a virusului, virusul este capabil să reproducă numai în linii special create de celule de ambalare care sintetizează aceste proteine \u200b\u200b(figura 1). În genomul acestor celule, genele virale (gag, pol și env) sunt încorporate astfel încât acestea să fie pe diferite cromozomi. Acest lucru reduce probabilitatea recombinării inverse a acestor gene în genomul viral inițial și formarea de viruși capabili de reproducere. După administrarea ADN-ului recombinant al furnizării în celulele de ambalare, acesta din urmă începe să producă un vector retroviral. ADN-ul provintor este administrat ca plasmid, în care o mică parte a genei GAG cu un semnal de asamblare și gene străine sunt închise între două pocăciuni lungi de capăt. Transfecția celulelor de ambalare sunt efectuate prin metoda standard. Mai multe modificări ale acestei abordări au fost dezvoltate pentru a reduce probabilitatea de recombinare pentru a forma un virus capabil de reproducere.
Celulele vizate. Abilitatea virusului infectează selectiv anumite tipuri de celule este, în esență, determinată de interacțiunea dintre proteina carcasei exterioare a virusului (retrovirusurile sunt codificate de gena ENV) și receptorul celular de membrană corespunzător. Virusul Lucemiei șoarecilor molone este ecotropic, adică infectează numai celulele șoareci. Pentru a extinde cercul celulelor țintă, se utilizează un mediu 4070a din leucemia șoarecilor. Această tulpină este celulele ampotropice și infecte nu numai șoareci, ci și alte mamifere, inclusiv o persoană. Pseudotyping, adică ambalajul genomului viral în carcasa care conține proteinele unui alt virus vă permite să extindeți cercul celulelor țintă. De exemplu, glicoproteina virusului stomatitei veziculoase, numită G-proteină, este ușor inclusă în carcasa virusului de leucoză de șoareci Molon. Prezența acestei proteine \u200b\u200bextinde cercul celulelor țintă și facilitează infecția. În plus, includerea proteinei G mărește stabilitatea vectorului retroviral și vă permite să obțineți un titru mai mare de viruși în ultracentrifugare. Lipsa proteinei G este toxicitatea sa în raport cu celulele de ambalare. Acest dezavantaj poate fi depășit parțial utilizând celulele de ambalare cu o expresie de proteină G indusă. Vectorii retrovirali care conțin alte proteine \u200b\u200bvirale, cum ar fi proteinele de virus de leucemie Gibbon sau virusul limfocitar choriomenant, sunt mai puțin toxice în ceea ce privește celulele de mamifere.
Aplicație. Cu ajutorul vectorilor retrovirali, transfecția celulelor pacientului ex vivo sau vectori este injectată direct în țesut. Prima abordare necesită eliberarea celulelor pacientului și le menține în cultură, infecția celulelor printr-un vector retroviral și introducerea ulterioară a celulelor pacientului. Așadar, a încercat să modifice limfocitele și celulele care formează stem în cazul formării de adenozină și hipercolesterolemie familială. În mod similar, a apărut exprimarea imunomodulatoarelor în celulele tumorale. Injectarea directă a vectorilor retrovirali încearcă să se aplice în principal pentru tratamentul tumorilor solide.
Siguranță. Deoarece virusul este încorporat în gena celulară (care este importantă pentru expresia lungă) și aleatorie, există riscul de mutație (introducerea mutagenezei). De exemplu, încorporarea unui virus poate schimba funcția diviziunii celulare de reglementare a genei, care va duce la consecințe nedorite. Retrovirusurile capabile de reproducere au o anumită carcinogenitate, dar acest lucru nu este observat în vectorii retrovirali lipsită de astfel de abilități.
HIV.- viruși (lentivirus.)
Virușii legați de acest subfamilia retrovirusurilor sunt capabili să infecteze atât celule divizate, cât și nearmate. HIV-1 este cel mai bine studiat din linteivirusuri, iar vectorii obținuți pe bază, au teoretic mai multe avantaje față de vectorii retrovirali descriși. Mai ales promițătoare este capacitatea lor de a transfecționa foarte eficient a celulelor care formează stem. Acești vectori pot oferi, de asemenea, o expresie pe termen lung a transgenului. Cu toate acestea, datorită originii vectorilor lentivirali, înainte de a efectua studii clinice, trebuie să vă asigurați de siguranța lor.
Ciclu de viață . Lentivirusul sunt similare cu alte retrovirusuri. Principala diferență care explică capacitatea lentivirusului de a infecta celulele notificabile este că complexul viral pre-constând interacționează cu teaca nucleară și apoi transportat prin el. Acest complex pre-constând constă dintr-un genom viral (sub formă de ADN), integrarea și proteina matricei codificate de gena GAG. Proteina de matrice conține o secvență care asigură legarea virusului cu uneori cochilia nucleară. Transferul ulterior al interiorului nucleului face posibilă integrarea genomului viral în ADN-ul celulei nonsens.
. Vectorii lentivirali sunt lipsiți de capacitatea de a reproduce din cauza eliminării din genomul HIV-1 a unor gene suplimentare, prin urmare, pentru prepararea lor, se utilizează celulele de ambalare în care genele independente codifică componentele necesare pentru asamblarea virusului. Acest lucru reduce semnificativ riscul de recombinare la primirea vectorului, ca rezultat teoretic, este posibilă restaurarea capacității virusului față de reproducere. Scoaterea genei TAT și repetiții terminale lungi (LTR) reduce, de asemenea, riscul de restabilire a capacității de a se reproduce la primirea unui vector sau in vivo.
Celulele vizate. Vectorii lentivrug sunt capabili să infecteze atât celulele divizate, cât și celulele decodificate, cum ar fi celulele care formează tulpini sau celule specializate - mușchi, neuroni, hepatocite, fotoreceptori retinici. Cu toate acestea, uneori pentru implementarea transfecției, este necesar să forțați celulele să se deplaseze în timpul perioadei G (ciclul celular. Pentru a extinde cercul celulelor țintă, proteina lentivirală codificată de gena ENV poate fi înlocuită cu pseudotyping pe proteina G a virusului stomatitei veziculoase sau pe o altă proteină adecvată. Expresia lungă a transgenovului livrată utilizând vectorul lentiviral a fost observată în CNS de animale experimentale. Furnizarea stabilă și eficientă a transgenelor se efectuează și în celulele retinei.
Aplicație vectorii lentivrug aproape nu provoacă inflamații sau alte semne de înfrângere a țesuturilor.
Siguranță. Deoarece vectorii lentivirali sunt obținuți pe baza genomului HIV-1, o preocupare specială determină riscul de recombinare care restabilește capacitatea de a se reproduce. Vectorul lentiviralului reproductiv este teoretic periculos prin faptul că poate provoca mutageneză inserție sau poate dobândi proprietățile originale HIV-1. De asemenea, nu este clar ce infecție cu HIV umană va fi tratată cu un vector de lentivirus. Teoretic, infecția cu HIV poate determina mobilizarea vectorială încorporată, deoarece HIV este capabil să acționeze ca un virus asistent. Apropo, acest lucru poate fi utilizat pentru terapia genică HIV utilizând vectori lentivirus. Învățăturile de securitate ar trebui eliminate în timpul îmbunătățirii proiectării vectorilor și a metodelor de pregătire a acestora.
Vectori bazați pe adenovirus
Adenovirusurile conțin ADN dublu catenar liniar și sunt capabili să reproducă independent de celula gazdă. Vectorii adenovirali au mai multe avantaje care stimulează dezvoltarea utilizării clinice. Acestea vă permit să livrați gene la diferite țesături umane, inclusiv în epiteliul tractului respirator, a endotelului, a miocardului și a mușchilor scheletici, a celulelor sistemului nervos periferic și central, a hepatocitelor, a celulelor ecorale ale pancreasului și a diferitelor tipuri de tumori. Este cunoscut mai mult de 40 de serotipuri de adenovirusuri umane, iar boala a provocat în detaliu în detaliu. Aproape toți adulții au mutat infecția adenovirală, iar în sângele lor există anticorpi împotriva adenovirusurilor.
Vectorii adenovirali oferă o transfecție eficientă a celulelor divizate, cât și cele nereducative, cu expresia ulterioară a transgenei. Puteți utiliza diferite căi de administrare, de exemplu, v / b, intraperistan, intravenos, intracranial, intratecal, precum și injectarea în moduri biliare sau direct în parenchimul de organe. Varietatea căilor introduse vă permite să alegeți cele mai bune pentru țintele selectate. Vectorii adenovirali au două dezavantaje esențiale. În primul rând, după infectarea celulei, gena virusului nu este încorporată în ADN-ul celulei, nu se produce o expresie atât de lungă a transgenului. În al doilea rând, infecția adenovirală activează ambele legături de imunitate celulară și umorală, ceea ce duce la distrugerea celulelor transfectate și reduce eficiența administrării repetate a vectorului. Efectele secundare ale vectorilor adenovirali sunt, de asemenea, explicați prin răspunsul imun.
Utilizarea vectorului adenovirus
Descrierea la figura 2. Adenovirusul recombinant este asociat cu receptorii specifici pe suprafața celulei țintă și pătrunde prin endocitoză. Proteinele virale oferă o priză de virus de la endosom la fuziunea sa cu lizozomul; Datorită acestui lucru, virusul evită distrugerea. ADN-ul adenoviral este eliberat din proteine \u200b\u200bși pătrunde în kernel, unde începe sinteza noului ARNm. În acest caz, ADN-ul adenoviral care conține o transgenă nu este încorporat în genomul celulei gazdă.
Ciclu de viață. Infecția adenovirală începe cu legarea firelor proeminente pe vârfurile capiului ikosaedral, cu receptorul virușilor de cocsificare și adenoviruselor situate pe membrana celulară (figura 2). Apoi, există o secvență de trei resturi de aminoacizi (APR-Gly-ASN), situate la baza pentonului viral, cu integrină celulară (AVV3- sau AVV5-integrină), ceea ce duce la endocitoza și la innerizarea virusului . Virusul lasă endozomul la fuziunea sa cu lizozomul și astfel evită digestia. ADN-ul viral pătrunde în nucleul celulei în care începe sinteza ARNm viral, iar diviziunea celulelor nu este necesară pentru acest lucru. În difuzarea celulelor la un nivel ridicat de infecție, genomul virusului în ADN-ul celulei are loc, totuși, acesta este un eveniment destul de rar care nu afectează în mod semnificativ aplicabilitatea vectorilor adenovirali. Expresia și replicarea genomului viral trece într-o anumită secvență, care este în mare măsură determinată de genele E1A și BEI situate în 5 "- regiunea genomului adenovirus. Aceste gene oferă transactivarea mai multor gene virale situate în з" .
Deoarece genele E1 participă la reproducerile adenovirusurilor, blocurile lor de îndepărtare sau, cel puțin, face dificilă reproducerea. Datorită structurii mai complexe a virusului, îndepărtați toate genele adenovirale sunt mai greu decât retrovirale. Sinteza proteinelor adenovirale după infecția celulară cu vectorii adenovirali existenți activează legăturile de imunitate celulară și umorală. În unele cazuri, acest lucru poate limita utilizarea vectorului datorită decesului celulelor transfectate și a eficienței scăzute a administrației vectoriale repetate.
Proiectare și primire vector . Dintr-o multitudine de serotipuri cunoscute de adenovirusuri, vectorii adenovirali de prima generație au fost utilizați pentru a obține vectori, vectorii adenovirali de prima generație au fost obținute prin eliminarea regiunilor E1 și E3 din genomul viral. După aceste deleții, virusul nu este capabil de reproducere, iar în genomul puteți include până la 7.500 de perechi de nucleotide ale ADN-ului străin. Zonele E2 și E4 sunt, de asemenea, eliminate în vectorii adenovirali de a doua generație, care contribuie la scăderea imunogenicității, dar reduce exprimarea transgenelor în celulele infectate. Ca urmare a eliminării unui număr și mai mare de gene virale, au fost obținute vectori adenovirus în funcție de virușii de ajutoare. Compoziția lor poate include mai mult ADN străin, iar atunci când sunt utilizate, riscul unui răspuns imun este redus, dar astfel de vectori sunt dificil de concentrat și sunt mai puțin stabili in vivo.
Vectorii adenovirali în cantități mari sunt obținute prin infecția celulelor de ambalare (de obicei celule de rinichi umane embrionare, linia 293), exprimând proteina virală E1, care compensează absența unei gene adecvate într-un virus recombinant. Apoi, celulele infectate sunt lizate, iar lizatul este supus centrifugării în densitatea gradientului de clorură de cesiu. Această metodă permite nu numai curățarea virușilor de la alte componente ale culturii celulare, ci și să o concentrați, primind mai mult de 1013 de viruși în 1 ml. Virusul purificat este foarte stabil în diferite soluții tampon, iar pentru depozitarea pe termen lung poate fi înghețată fără pierderea activității.
Celulele Mishenia . Adenovirusurile infectează o gamă largă de celule de divizare și slăbire, deoarece receptorii pentru cocsiunile și adenovirusurile sunt disponibile în aproape toate celulele. Doar unele celule ale acestor receptori sunt puține sau nu inaccesibile. Există modalități de a schimba traseul adenovirusurilor. Utilizarea anticorpilor de specificitate dublă față de firele de virus și celulele membranei ale celulei vă permite să blocați tropalizarea naturală a virusului și să o redirecționat la un anumit tip de celulă. Este posibilă modificarea firelor de virus sau capetele de capăt pentru a modifica firele de virus sau capetele de capăt pentru a modifica celulele celulelor pentru a modifica genele ingineriei genetice. În cele din urmă, pot fi utilizate proteine \u200b\u200badaptor, de exemplu, o proteină himerică care conține secvența factorului de creștere epidermică și receptorul de viruși și adenovirusuri. Acest lucru facilitează legarea virusului cu celulele care exprimă receptorul factorului de creștere epidermal.
Aplicație. În prezent există o mulțime de studii clinice în care vectorii adenovirali sunt utilizați pentru a trata atât bolile ereditare, cât și dobândite. În tratamentul bolilor ereditare, lipsa dezavantajelor este expresia transgenisului pe termen scurt și răspunsul imun la celulele infectate. Localizarea extrachromozomă a genomului adenoviral în celulă limitează durata expresiei transgenelor în celulele care se împarte activ (de exemplu, celulele măduvei osoase sau epiteliul), deoarece diviziunea celulară nu este însoțită de replicarea transgenică. Vectorii adenovirali, ambii capabili, cât și nu pot fi utilizați în tratamentul neoplasmelor maligne.
Siguranță. Principalul efect secundar al vectorilor adenovirali este un răspuns imun îndreptat împotriva celulelor infectate. Discutarea siguranței vectorilor adenovirali a stimulat, în special, moartea unui pacient în timpul studiilor clinice. Există, de asemenea, îndoieli că în procesul de obținere a vectorului, formarea unui vector recombinant capabilă de reproducere este complet eliminată. Vectorii adenovirali concepuți pentru utilizarea clinică au nevoie de un control aprofundat.
Adenorasoed.viruși
Aceste virusuri mici, defavorizate care conțin ADN cu catenă unică au o serie de proprietăți necesare unui vector bun. Ele nu sunt propogene, asigurați o transfecție eficientă și stabilă a celulelor de slăbire și, în plus, elimină expresia proteinelor virale în celulele infectate. Principalele dezavantaje ale vectorilor bazați pe adenină sunt mici recipiente și dificultăți în concentrație. Testele clinice ale vectorilor asociați cu adenină au început și există motive pentru a se baza pe adecvarea lor pentru terapia genică.
Ciclu de viață. Pentru reproducere, virusurile asociate adeninei au nevoie de informații genetice ale virusului asistent. În ciclul de viață al virusurilor asociate cu adenină, două faze sunt izolate. Un astfel de virus infectează cușca, se aprinde la genomul celular și în absența unui virus asistent (adenovirus) acolo rămâne acolo pentru o lungă perioadă de timp în starea latentă. În prezența adenovirusurilor, începe faza activă, ducând la reproducerea virusului de adenoizolare și liza celulară. Gena virusului asociat adeninei conține două cadre deschise de citire (GER și CAP), limitate de repetițiile finale inversate (ITR). Pentru reproducerea virusului, sunt necesare numai Gers pentru a codifica patru proteine \u200b\u200bcare asigură reproducerea virusului asociat adeninei, transcrierea ADN-ului viral și activitatea endonucleazei necesară pentru încorporarea în genomul celular. Proteinele structurale care formează capexidul virusului sunt codificate de genomul capacului. În zona repetărilor terminale inversate există puncte de returnare a replicării; Aceste repetări conțin semnale pentru asamblarea virușilor și, de asemenea, să participe la încorporarea ADN-ului viral în gena celulară. Funcția multor proteine \u200b\u200bși alte caracteristici ale biologiei virusului a devenit cunoscută după studiul virușilor nemodificați naturali.
Infecția începe cu atașamentul virusului la receptorul principal pe cell - proteoglican care conține heparatulfat. În penetrarea virusului în celulă, receptorul factorului de creștere a fibroblastelor și al SC, P5-Integrin, de asemenea, participă. Intermanția virusului este efectuată prin endocitoză prin formarea unei vulpe acoperite. În interiorul celulei genei virusului adenosass, inelul este închis în inel și formează concaderii inelari în afara cromozomilor. Formarea acestor forme de inel ale genomului viral este însoțită de expresia lungă a transgenului. Virusul natural ADO asociat poate fi integrat în ADN-ul uman într-o singură secțiune a celui de-al 19-lea cromozom (19Q 13.3-Qter). Virusul recombinant uneori pierde această abilitate. Proiectarea și primirea vectorului. Vectorii asociați cu ADO existenți sunt obținuți utilizând un sistem de plasmidă recombinant. Prima plasmidă conține o transgenă situată între două repetări terminale inversate, a doua gement de Gen și CAP, iar secțiunile a treia ale genomului adenovirus necesare pentru asamblarea virusului asociat adenoasei. Această abordare ajută la efectuarea fără infecție suplimentară a celulelor producătoare de adenovirus. Datorită dimensiunii mici a genomului de virusuri generale adenine în vector, pot fi incluse mai mult de 5.200 de perechi de nucleotide de ADN străine. Acest lucru nu numai că limitează dimensiunea potențialului transgenei, ci face dificilă utilizarea unor promotori și îmbunătățiri speciali care guvernează expresia într-o celulă infectată. Când utilizați un sistem de două meciori, puteți dubla capacitatea vectorului: două jumătăți ale transgenei sunt conectate in vivo de doi vectori diferiți, care sunt combinate în concurența inelară din interiorul celulei. În același mod, genele mari pot fi colectate sau incluse elemente de reglementare importante, prea mari pentru un singur vector. În prezent, principalele probleme în utilizarea vectorilor asociați cu adenină sunt asociate cu dificultățile de obținere a unei concentrații ridicate a vectorului și determinarea titrului său. Celulele vizate. Vectorii asociați adino sunt capabili să infecteze diferite celule. În studiile preclinice, sunt prezentate o transfecție eficientă a celulelor musculare scheletice, SNC, plămâni, ficatului, tractului gastrointestinal.
Aplicație. Vectorii asociați adino au început să se aplice în clinică: acum sunt ținute studiile clinice ale livrării genetice în plămâni și mușchii scheletici. Aparent, acești vectori sunt potriviți pentru asigurarea unei expresii pe termen lung a transgenei în mușchii scheletici, inima, sistemul nervos central și alte țesuturi. Primele rezultate ale studiului clinic în care, cu ajutorul vectorilor asociați adeninei, expediate generatorul transportului IX în mușchii scheletici ai pacienților cu hemofilie au avut succes (vezi mai jos). Abilitatea acestor vectori de a furniza o expresie pe termen lung a transgenelor fără a face acțiuni toxice asupra celulelor și fără a provoca un răspuns imun, le face un instrument promițător pentru tratarea unor boli ereditare.
Siguranță. Virusurile asociate adino sunt nepagogene. Primele experimente care utilizează vectorii corespunzători au arătat că nu activează sistemul imunitar. Anterior, temerile au fost exprimate că vectorul asociat adeninei ar putea fi contaminat cu un virus asistent (adenovirus), dar acest risc a lichidat noi scheme de obținere a vectorilor. În cele din urmă, vectorii asociați adeninei pot fi integrați în gena celulară aleator, ceea ce teoretic poate duce la mutageneză de inserție. Probabil, este necesar să se mențină abilitatea unei încorporări specifice în cel de-al 19-lea cromozom
Herpessvirus
Acest virus conține o moleculă de ADN cu două perechi de 152.000 de nucleotide), care este reprodusă în nucleul celulei infectate. Virusul infectează diferite celule, atât divizate, cât și depuse; Genomul de virus este în afara cromozomului. În genomul viral prin recombinarea omoloagă sau prin ștergere și inserție, este posibilă încorporarea a până la 20.000-30.000 de nucleotide ale ADN-ului străin. Virusul simplu de herpes de tip 1 are tropiness la neuroni, astfel încât este propus să fie utilizat ca vector pentru genoterapia bolilor nervoase, cum ar fi boala Parkinson sau neoplasmele creierului malign. Principalele dezavantaje ale acestui vector sunt citotoxicitatea și posibilitatea de a strânge transgena.
Ciclu de viață . Infecția cauzată de o varietate de herpes de tip 1 poate fi activă, ceea ce duce la liza celulelor sau latentă. În infecția primară, virusul pătrunde în celulele epiteliului (din piele sau membrane mucoase), unde este reprodus. Noi viruși, lăsând o celulă infectată prin recuperare, primesc o carcasă exterioară constând din resturi de membrană celulară. Apoi, virușii sunt încorporați în nervi sensibili lângă centrul infecției primare și retrogradul sunt transportate cu fibre în corpul neuronului. În atașarea virusului, moleculele heparasulfate sunt implicate pe suprafața membranei celulare. Odată în corpul neuronului, virusul poate continua reproducerea activă sau poate merge la starea latentă. În acest din urmă caz, expresia celor mai multe gene virale este suprimată, dar doi promotori (LAPI, LAP2) activează sinteza transcrierilor asociate cu latența (transcrieri lat). Mai târziu, virusul poate reactiva, începe o reproducere activă și se răspândește în centrul infecției primare sau ale SNC.
Proiectare și primire vector . Vectorul Herpesviral nu este capabil de replicare, deoarece nu are mai multe gene necesare pentru acest lucru, cum ar fi ICP4, 1srol ICP27 gene urinoase. Îndepărtarea acestor gene reduce, de asemenea, citotoxicitatea vectorului și crește durata expresiei transgengene. Au fost dezvoltate metode care să permită virusurilor de ajutor pentru a obține vectori de virus Herpes, deși cu un titru scăzut. Astfel de vectori sunt capabili să infecteze celulele nervoase in vivo, fără a le deteriora. Cele mai eficiente metode de obținere a unui vector bazat pe o varietate de virus de tip 1 vă permit să includeți două transgenis independenți.
Un obstacol mare în calea utilizării vectorilor herpesvirus este o expresie pe termen scurt cauzată de postația transgenă. O modalitate promițătoare de a depăși această problemă este utilizarea promotorilor care activează sinteza transcrierilor din Lat. Uneori, pentru a facilita difuzarea, transgena este cusută cu situsul de legare a ribozomului intern (IRES) al virusului enceflomiocardită.
Celulele Mishenia . Virusul simplu de herpes de tip 1 este capabil să infecteze diverse celule umane, dar traseul său este exprimat în special la neuroni. Pentru a crește specificitatea, genele virale care codifică glicoproteina sunt îndepărtate (asigură atașamentul la celulă); Ele pot fi înlocuite cu alte gene similare.
Aplicație. Rezervorul de vectori Herpesvirus este foarte mare. De exemplu, cu ajutorul lor în cultura celulelor musculare, obținute de la șoareci cu distrofie musculară experimentală, a fost introdus un cADN complet de distrofină de la 14.000 de perechi de nucleotide. Vectorii herpestvirus capabili de reproducere sunt acum dezvoltați pentru tratamentul neoplasmelor maligne ale creierului și a altor organe. Siguranță. Principalul pericol al vectorilor herpesvirus - citotoxicitate. Cele mai noi metode de producere a vectorilor, inclusiv eliminarea genelor virale suplimentare, reduc acest risc.
Postat pe Allbest.ru.
Documente similare
Schimbul de material genetic în bacterii în timpul transformării, conjugării și transducției. Transferul fragmentului ADN de la celulele bacteriene donatoare la destinatar cu contact direct. Transferați, gene de structuri speciale și necesare necesare pentru conjugare.
rezumat, a adăugat 05/27/2010
Principalele prevederi și etape ale procesului de exprimare a genei. Transferarea informațiilor despre secvența ADN nucleotidică la nivelul ARN. Prelucrarea ARN în procariote. Codul genetic, scopul său și procedura de formare. Caracteristicile generale ale procesului de difuzare.
cursuri, a fost adăugată 27.07.2009
Evoluția reprezentărilor genei. Metode de bază pentru identificarea genelor de plante. Clonarea pozițională (alocare) a genelor marcate cu mutații. Selectarea genelor marcate de deleții prin metoda de scădere genomică și folosind metoda de delet-a-gen.
lucrări de testare, a fost adăugată 03/25/2016
Conceptul și principalele metode de inginerie genetică. Tehnica de izolare a ADN-ului cu privire la exemplul ADN-ului plasmidic. Principiile de funcționare a modificării sistemului de restricție. Transferul și detectarea genelor clonate în celule. Proiectare și administrare în celulele moleculelor de ADN recombinant.
eseu, a adăugat 01/23/2010
Descrierea interacțiunii complementare a genelor. Luarea în considerare a caracteristicilor caracteristice ale modificării și modelelor ereditare (combinative, mutaționale) ale variabilității corpului. Sarcini și metode de selecție a plantelor, animalelor și microorganismelor.
rezumat, a adăugat 07/06/2010
Etapele de efectuare a experimentelor privind transferul materialului genetic, utilizarea tehnologiilor pentru studierea proceselor de diferențiere, a carcinogenezei. Condiții de cultivare a celulelor. Tipuri și numire de selecție. Transferarea genelor mediate de cromozomi și ADN.
tutorial, a adăugat 11.08.2009
Mutageneză inservată ca metodă de genetică directă și inversă. Tipuri de mutageni de inserție și caracteristicile acestora. Utilizarea mutagenezei de inserție pentru a inactiva genele pe baza fenomenului interferenței ARN. Selectarea genelor marcate cu inserție.
lucrări de testare, a fost adăugată 03/25/2016
Retrovirus ciclu de viață. Infecția cu celule cu retrovirusuri. Mutații spontane și induse. Procesele de bază care duc la mutații. Clasificarea mutațiilor pe diverse criterii. Efectele mutațiilor pentru organism, transferul genelor.
rezumat, a fost adăugat 05/21/2015
Exprimarea diferențială a genelor și semnificația sa în activitatea vitală a organismelor. Caracteristicile reglementării activității genetice în eucariote și caracteristicile acestora. Operonii inductibili și represivi. Niveluri și mecanisme de reglementare a expresiei genelor în procariote.
prelegere, adăugată 31.10.2016
Latență și virginitate ca tipuri de interacțiuni virusului cu o celulă. Procesul de adsorbție a virusului și penetrarea acestuia în celulă, sinteza proteinelor virale. Etapele de coacere a particulelor virale subsidiare, metode pentru ieșirea lor din celulă, principiile generale de asamblare a viriunilor.
Lentivirusul aparține retrovirusurilor și se caracterizează printr-o perioadă mai lungă de incubare. Avantajul terapeutic al vectorilor bazați pe lentivirusuri, comparativ cu vectorii retrovirali, este capacitatea lor de a transfera fragmente lungi de informații genetice în celula infectată genetică. Aceste vectori se bazează în primul rând pe virușii imunodeficienței umane (HIV) și pe taur și au toate caracteristicile unice ale vectorului viral Momlv, precum și capacitatea de a transfera gene în celulele postmitice. in vitro. și in vivo. (optsprezece). În ciuda confirmării transferului efectiv al genelor în celulele canceroase pe modelele de tumori solide care utilizează vectori pe bază de HIV, utilizarea terapeutică a acestor vectori cauzează preocupări, deoarece HIV este un agent patogen grav. Cu toate acestea, se efectuează studii clinice ale vectorilor lentivirali, care vizează evaluarea siguranței utilizării lor în terapia SIDA (19). Schests sunt considerate vector bazat pe lentivirus taur. Un exemplu de astfel de vectori servește ca un virus de boală Safe JDV (virusul bolii Jembrana), lovind anumite tipuri de bovine în județul Jambian pe insula Bali din Indonezia (20, 21). Virusul JDV are aceleași avantaje ca și vectorul ca HIV: este capabil să se înmulțească intens și să se integreze în celulele cromozomice neproliferator.
(B) vectorii adenovirus
Unul dintre sistemele cele mai bine învățate și utilizate pe scară largă pentru livrarea genelor terapeutice la celulele canceroase umane sunt vectori bazați pe adenovirusuri (AV, Vector adenoviral - AV). Ele sunt deosebit de utile în cazurile în care sunt necesare numai produse temporare ale genei terapeutice. Adenovirusurile sunt capabile să reproducă în cantități mari și sunt caracterizate de transferul efectiv al genelor la diferite tipuri de celule canceroase (22). Doi vectori bazați pe adenovirusuri au fost aprobate în China pentru utilizare clinică (23).
În plus, mai mulți vectori bazați pe câine, carne de porc, oi, adezivi bullish și păsări au fost proiectați pentru terapia genică a cancerului uman. Unul dintre acești vectori a demonstrat eficacitatea terapeutică asupra modelului de cancer de prostată la animale (24).
Principala problemă generată de dezvoltarea vectorilor adenovirali pentru terapia cancerului este infaminarea insuficientă a virușilor. În prezent, se efectuează studii intensive care vizează îmbunătățirea acțiunii și eficacității terapeutice a vectorilor addenovirali recombinanți (25).
(C) vectori bazați pe viruși asociați adeno
Vectorul de pe baza virușilor asociați adeno (AAAV, virusul adeno-asociat - AAV) nu provoacă efecte toxice și prezintă o infecție ridicată, așa cum au fost raportate teste preclinice ale unor astfel de viruși (26). Pe modelele de glyom din rozătoare, sa demonstrat că AAV, care codifică receptorul factorului de creștere a endotelilor vasculare (factorul de creștere endotelial vascular), este capabil să blocheze creșterea tumorilor. În ciuda eficienței ridicate a AAA, tehnologia pregătirii și compensării acestora este un proces destul de complicat și mai scump (27).
(D) vectori bazați pe virușii Herpes
Datorită eficienței ridicate și nu o metodă complicată de obținere, vectorii bazați pe virușii Herpes sunt deosebit de populari printre dezvoltatorii de sisteme vectoriale. În prezent, cu multe variante de vectori terapeutici bazați pe viruși de herpes, sunt efectuate studii clinice. Ca și în cazul vectorilor pe baza altor viruși, numai replicarea și tulpinile competente ale virușilor Herpes reprezintă interesul terapeutic. Primul vector de acest tip a fost creat pe baza unui virus mutant herpes cu un genom defect r34.5.Responsabil pentru neurotoxicitatea virusului. Inactivarea genelor r34.5. A limitat capacitatea virusului de a reproduce în celulele sistemului nervos central și a blocat posibilitatea existenței sale în forma latentă. Cu toate acestea, mai târziu sa constatat că lipsa activității genei r34.5. A redus semnificativ capacitatea unui virus mutant de a reproduce în celulele canceroase (28).
Capacitățile terapeutice ale vectorilor bazate pe virușii Herpes pot fi limitate semnificativ la imunitate la acesta la pacienți. Răspunsul imun al organismului împiedică virușii genelor terapeutice la organele periferice și cauzele hepatotoxicității. Cu toate acestea, unele tulpini mutante de virusuri Herpes au demonstrat tratamentul cu succes al cancerului de ficat la modelele de șoareci, datorită oamenilor de știință, oncolismului viral direct și activității celulelor efectoare specifice ale sistemului imunitar (29).
(E) vectori virali vizați
Principala problemă legată de genoterapie cu vectorii virali rămâne eficiența scăzută a livrării de adrese a genelor în celulele canceroase. Pe drum spre celula țintă, virusul se confruntă cu un obstacol fizic - peretele endotelial al vaselor. Fiind una dintre modalitățile de rezolvare a acestei probleme, a fost dezvoltat un vector adenoviral, care vizează mecanismul de tranzioză a receptorului (trecerea prin celulele endotelialului) folosind molecule de adaptare specială (32). Particulele de virus supuse transcitozei au menținut capacitatea de a infecta celulele, dar eficiența virușilor transportate prin celule a rămas scăzută. Vectorii adenovirali se dezvoltă în prezent conținând ambele molecule de semnal care ghidează viruși asupra transcitozei și moleculelor care încurajează obligarea și infectarea celulelor canceroase care sunt "pe cealaltă parte" ale pereților navelor (33).
(E) particulele multifuncționale bazate pe vectori virali
Conceptul de particule multifuncționale (IFC) bazate pe vectori virali a apărut relativ recent. Scopul său este de a se asigura că vectorii virali terapeutici efectuează imediat mai multe funcții: livrarea de adrese a materialului genetic este în celulele canceroase, le-a permis să le vizualizeze în organism și ar avea un efect progresiv oncolitic. De exemplu, MFG pe baza vectorilor virali poate fi cauzată de AAA cu proteine \u200b\u200bmodificate "spikes", situată pe carcasa virusului (cu ajutorul vârfurilor, virusul interacționează cu celula țintă). Modificările au permis simultan viruși "țintă" asupra celulelor canceroase și vizualizarea mișcării, reproducerii și distribuției AAA. Interacțiunea HSV TIMIDIN-KINASE TC, situată pe suprafața AAA modificată, cu un substrat bine-cunoscut pentru tomografia de emisie de pozitroni (tomografia de emisie positronică, PET) 18F-Penciclovir (18F-Penciclovir) permite monitorizarea particulelor virale în clinică practică. În plus, enzima TC HSV deschide posibilitățile pentru așa-numita terapie genică sinucidere, a cărei esență este după cum urmează: Enzima BTC convertește substraturile sale (astfel de medicamente ca ganciclovir) în metaboliți recunoscuți de enzimele celulei infectate . Efectul secvențial al proteinelor celulare asupra acestor metaboliți duce la formarea unui produs finit toxic care provoacă moartea celulelor (34). Interesant, producția de TC HSV infectată cu o celulă tumorală induce auto-distrugerea celulelor adiacente, care se manifestă printr-una dintre proprietățile IFC - un efect progresiv oncolitic.
Conceptul de MFG bazat pe vectorii virali deschide aplicații largi de nanotehnologie. Monitorizarea particulelor virale poate fi efectuată cu ajutorul etichetelor nanometrice imobilizate pe cochilii de viruși (35). Cu toate acestea, problema livrării de adrese a IFF virale în celula tumorală rămâne deschisă.
Mecanisme de genoterapie care utilizează vectori virali
(A) Adăugarea corecțională a Gena
Toate bolile oncologice sunt luate pentru a subdiviza P53-Dependent și P53 independent, deoarece majoritatea cazurilor de cancer sunt mediate de mutații în gena genei p53.. Proteina P53 este un supresor cunoscut al tumorii, al cărei funcții principale este de a menține stabilitatea genomului. Acesta participă la reglarea ciclului celular, în corectarea defectelor ADN emergente și în moartea celulelor programate cu apă. Efectele asupra celulelor factorilor care cauzează schimbări în structura ADN-ului, cum ar fi radiația ultravioletă, radiațiile ionizante și diversele substanțe chimice, conduc la activarea proteinei P53, ceea ce induce fie arestul ciclului celular, necesar pentru corectarea defectelor ADN-ului (reparații) sau lansează mecanismul de apoptoză. Din acest motiv, mutația în gena p53. Poate duce la proliferarea și mutageneza celulară necontrolată, indiferența față de apariția și progresia neoplasmului malign.
Teste preclinice au arătat că înlocuirea unei gene mutante p53. În celulele canceroase, gena de tip sălbatic (fără mutații) cu ajutorul metodelor de terapie genetică, duce la restabilirea completă a funcțiilor proteinei P53 și începe apoptoza celulelor maligne (36,37).
Studiile clinice ale vectorilor retrovirali și adenovirali care transportă gene intacte p53.sa dovedit a fi eficiente în înlocuirea genelor defecte p53. La pacienții care suferă de cancer pulmonar mic (NMLL, cancer pulmonar de celule mici - NSCLC) și carcinom bronhoalveolar (38.39,40). Din păcate, în studiile clinice nu a fost posibilă detectarea unui efect terapeutic semnificativ chiar și cu utilizarea în comun a vectorilor adenovirali recombinanți de gena p53. Tipul sălbatic și chimioterapia (41).
(B) terapia genică suicidară
Esența terapiei genetice sinucidere este de a livra la gene maligne ale unei gene care codifică o enzimă care transformă promedicamentul la medicament - "toxină suicid", provocând moartea celulelor canceroase infectate. Un exemplu viu de enzimă de sinucidere este o timidicinază (TC) a unui virus simplu Herpes (virusul Herpes Simplex - HSV). TK HSV transformă analogii non-toxici ai nucleozidului, cum ar fi ganciclovir sau aciclovir, în substanțe toxice care au dus la moartea celulelor. Ca și metoda de transfer adenovirală descrisă mai sus, testele preclinice ale vectorului adhsv tk (adenoviral HSV TK), care codifică TC HSV, au demonstrat moartea nu numai a celulelor infectate, ci și adiacente cu administrarea sistematică a lui GancLovir. Efectul este explicat atât prin impactul toxinelor eliberate de celulele infectate în celulele vecine, cât și la răspunsul sistemului imunitar de infecție (42).
100 R. Bonus pentru prima comandă
Alegeți tipul de lucru Tipul de lucru Diplomă Curs de lucru Abstract Răspundeți la partiune Raportul raportului Examinați Specificație Monografie Soluție Sarcini de afaceri Planul de lucru Răspunsuri la întrebări Creative Lucrare Esemy Desen eses Traducere Prezentare set Text Alte îmbunătățire Text Text Candidat Disertație Laboratorul Lucrări on-line
Să aflați prețul
Vectorii retrovirali
Experiența studiilor clinice cu participarea mai mult de 200 de pacienți arată că vectorii retrovirali defecți la replicare nu au efecte secundare adverse. Cu toate acestea, aplicațiile lor continuă să atribuie o importanță deosebită. Creat construcție, numită Plasmovirus, care conține gene retrovirale gag.și poh.sub control 5 "-Ltr-NPomotopa, o genă și gena" terapeutică "și gena env,promotorul citomegalovirus controlat. După transfecție, plasmovirusul lansează formarea defectuoasă pentru replicarea particulelor virale, iar probabilitatea de recombinare cu formarea retrovirusurilor competente asupra replicării este foarte mică. Vectorul poate purta nu mai mult de 3,5 tone. N. ADN, dar și lungimea majorității cADN-ului potențial "terapeutic" și gene - supresoare tumorale este de 0,5-2 t. N.
S-au făcut îmbunătățiri suplimentare la sistemul vectorial retroviral: numărul de particule de virus format a fost crescut, a fost crescută eficiența transducției, a fost efectuată o modificare a ingineriei genotare, ceea ce asigură penetrarea lor în celule îndoite, specificitatea crescută a infecției. În acest din urmă caz, vectorul retroviral recombinant este ambalat în carcasa altui virus, a cărui proteină determină specificitatea legării retrovirusului și a spectrului celulelor infectate cu ele. Acest fenomen se numește amestecare fenotipică (Formarea pseudotype).Virusul mixt fenotipic este obținut folosind cotransfecția celulară, care sintetizează produsele genetice gag.și pol.vector retroviral recombinant și gena care exprimă vectorul en.un alt virus. Schimbarea genei. env,aveți amândoi să îngustați spectrul celulelor infectate cu un virus la un tip strict definit și să îl extindeți. În plus, în gena en.retrovirus Puteți integra o secvență nucleotidică care codifică o peptidă care se leagă la un receptor de celule specifice și asigură introducerea unui retrovirus recombinant în celulele necesare. În cele din urmă, este posibil să se realizeze specificitatea expresiei genei terapeutice, realizând-o sub controlul promotorului specific anumitor celule.
Adenovirus vectori
Adenovirusurile infectează celulele umane de avertizare și sunt utilizate pe scară largă ca vaccinuri vii care împiedică infecțiile respiratorii și gastroenterita, fără a furniza efecte secundare. Aceste proprietăți fac adenovirusuri promițătoare pentru livrarea genelor la celulele vizate.
Pentru a obține vectorul adenoviral, linia celulară a fost efectuată de linia celulară sintetizarea produselor genei adenoviral E1, două secțiuni ale genomului adenovirus (figura 21.7). Unul dintre ei poate exista sub formă de Gatazmid în E coli.Și conține în loc de gena "terapeutică" de registru E1, flanșă prin secvențele nucleotidice ale adenovirusului, iar cea de-a doua este molecula ADN adenovirus, care este lipsită de porțiunea de 5 ", cuprinzând o regiune EL și are o suprapunere zonă cu o genă de plasmidă terapeutică lagăr. Recombinarea între două fragmente de ADN transfected în regiunea suprapunerii lor conduce la restaurarea unei gene de adenovirus de dimensiuni mari, în loc de regiunea E1 este gena terapeutică. Produsele genei E1 furnizate de celula gazdă inițiază formarea particulelor virale eliberate din celulă ca urmare a lizei. În absența moleculelor de transfecție a recombinării ADN-ul cu o lungime insuficientă nu poate fi ambalat în particule de virus. Probabilitatea ca între regiunea E1 în genomul Celula gazdă și adenovirusul recombinant ADN va primi recombinare cu formarea de viruși competenți, extrem de mici.
După ce adenovirusul recombinant infectează celula țintă, ADN-ul său pătrunde în kernel, unde apare expresia genei "terapeutice". ADN-ul recombinant nu se integrează în cromozom și persistă timp scurt, astfel încât atunci când conduceți terapia genică utilizând vectori adenovirali, este necesar să le introduceți cu o anumită frecvență.
Vectorii adenovirali au fost utilizați în studiile clinice la terapia genică a făinii și a codurilor.
Vectorii adenovirali tolerează efectiv genele atât în \u200b\u200bcelulele divizate, cât și celulele decodificate nu sunt încorporate în genom, furnizează titruri mari ale unui virus recombinant și un nivel ridicat de exprimare a genelor administrate. Cu toate acestea, vectorii adenovirali utilizați în prezent provoacă inflamație nespecifică și reacție antivirus a imunității celulare, care reduce durata expresiei în săptămâni sau luni.
Dezavantaje ale vectorilor retrovirali, încurajați să căutați alte sisteme vectoriale. Cele mai mari speranțe sunt fixate pe adenovirusuri și herpesvirusuri. Genoamele din aceste virusuri sunt reprezentate de ADN dublu catenar și sunt suficient de mari: 36 kb în adeno- și 150 KB la Herpesvirusuri. De obicei, ele nu sunt integrate în genomul celulei gazdă (deși pentru herpesvirusuri și raportate la integrarea părților individuale de ADN viral).
Multe serotipuri convenționale de adenovirus sunt agenții patogeni umani care infectează tractele respiratorii superioare. Adenovirusurile intacte au fost utilizate în scopuri de vaccinare și, ca urmare, multe informații s-au acumulat pe securitatea acestui sistem pentru o persoană. Adenovirusurile pot fi obținute cu titruri foarte mari, până la 10 12 particule infecțioase în mediul de mediu de cultură. În scopul terapiei genice de astăzi, au fost utilizați două serotipuri adenovirus ca vectori, 2 și 5. adenovirusurile penetrează celula, interacționând cu doi receptori. Ele sunt bine adaptate în scopul terapiei in vivo, deoarece dau titruri mari de particule virale. Adenovirusurile sunt capabile să se reproducă atât în \u200b\u200bcelulele FISSILE. Ele nu sunt integrate în genomul celulelor gazdă și rămân epicomozomi. Acest lucru reduce pericolul de introducere a mutagenezei, despre care am vorbit în caz de retrovirusuri. Infecția celulelor permisive de către adenovirus duce la liza lor. Gena adenovirus schematic este prezentată în fig. 3. Genomul adenoviral poate fi transformat într-o replicare defectuoasă prin ștergerea regiunii E1. (Aici este necesar să se facă o rezervare că cerința genei E1 pentru replicare nu este absolută. Cu o mare multiplicare a infecției, o anumită replicare este încă observată în defectă în regiunea E1 a adenovirusurilor. Cu toate acestea, această abilitate este foarte puternic suprimată ). În loc de regiunea E1, o transgenă poate fi inserată cu aproximativ aceeași dimensiune ca în cazul vectorilor retrovirali, adică. până la 10 kb. Pentru a asigura creșterea unor astfel de virusuri recombinante defectuoase de replicare, sunt create celule recombinante speciale conținând gene de expresie E1. Este foarte asemănător cu acel truc, care a fost folosit în cazul retrovirusurilor. Aceste celule completează defectul vectorului adenoviral și îl permit să se înmulțească și să formeze particule virale care nu pot fi reproduse în celule necomodificatoare. În fig. 3 prezintă locurile în care poate fi construită transgena. Acestea sunt zonele E1a, E1B și E3. Vectorii adenovirali au fost utilizați recent pentru livrarea eficientă a genelor la celulele epiteliale ale tractului respirator superior in vivo. Acest epiteliu este un loc de infectare naturală pentru majoritatea adenovirusurilor, astfel încât adenovirusurile au un avantaj față de retrovirus, deoarece acestea din urmă, deși pot fi reproduse în epiteliul nu pot fi obținute într-o concentrație suficient de mare pentru tratamentul terapiei in vivo. Cu toate acestea, localizarea epichromozomală are dezavantajele - durata expresiei transgene este mică - săptămâni, în cele mai bune luni. Și mi-ar plăcea mai mult, aș vrea pentru viață, pentru că ne confruntăm cel mai adesea cu ereditare, adică. Bolile pe durata vieții. Ca urmare, vectorii adenovirus vor trebui să intre pacienții care nu sunt o dată și în mod regulat. Organismul va rezista la astfel de violențe?
Cuprins al subiectului "Biotehnologie. Inginerie genetică. Terapie genetică".:1. Biotehnologie. Știință biotehnologie. Etape de dezvoltare a biotehnologiei.
2. Domenii de utilizare a biotehnologiei. Zonele de utilizare a biotehnologiei. Optimizarea proceselor microbiologice în biotehnologie.
3. Utilizarea industrială a microorganismelor. Producția de produse de sinteză microbiană. Fabricarea de antibiotice. Producția de vaccinuri.
4. Ingineria genetică. Biosecuritate. Relevanța ingineriei genetice. Baza teoretică a ingineriei genetice.
5. Organizarea materialului genetic în celulă. Genotip. Ce este ingineria genetică? Etape de obținere a produselor genetice.
6. Aplicarea metodelor de inginerie genetică. Indicații (Justificare) Aplicarea ingineriei genetice. Cauzele ingineriei genetice.
7. Biosecuritatea în ingineria genetică. Documentele biosecurității de reglementare.
8. Grupuri de pericol de microorganisme. Evaluarea riscurilor a utilizării microorganismelor modificate genetic.
9. Diagnosticul genei. Terapia genică. Ce este diagnosticarea genetică și terapia genetică? Tipuri de terapie genică.
10. Vectorii. Vectori bazați pe viruși conținând ARN. Vectori bazați pe virușii genomici ADN. Vectori nevivari.
11. Perspective ale terapiei genetice. Viitorul terapiei genetice. Sarcinile terapiei genice.
Vectori. Vectori bazați pe viruși conținând ARN. Vectori bazați pe virușii genomici ADN. Vectori nevivari.
Așa cum am menționat mai sus, diverse utilizare a diferitelor gene pentru a transfera genele corespunzătoare în celulă vectori [din Lat. Vector, Carrier]. Principala problemă a dezvoltării lor este de a depăși bariera imunologică a beneficiarului, care îmbunătățește organismul de diferite influențe externe, inclusiv din introducerea ADN-ului străin în gena celulelor. În acest sens, virușii sunt de interes deosebit, deoarece toți agenții cunoscuți sunt capabili doar de integrarea mai mult sau mai puțin cu succes a materialului genetic în genomul celulelor umane. Prin urmare, toate eforturile specialiștilor cu terapie genetică sunt în prezent concentrate în domeniul ingineriei genetice a virușilor utilizați ca vectori care oferă gene terapeutice în celulele organismului pacientului.
Vectori bazați pe virușii care conțin ARN
ARN Virusuri genomice Ușor de integrat în genomul celulei gazdă, asigurând astfel o expresie pe termen lung a genei necesare. Pentru a crea vectori terapeutici genetic, retrovirusurile sunt cele mai promițătoare. Aproximativ 60% din toate încercările clinice de terapie genică au avut loc cu participarea lor.
Retrovirusuri Relativ inofensiv pentru oameni, excluzând, desigur, viruși umani HIV și T-limfotropic. Cel mai adesea, virusul leucemiei șoareci este folosit ca vector. La dezvoltarea vectorilor din compoziția lor, genele care codifică sinteza produselor care furnizează reproducerea sunt complet excluse. Rezervorul de codificare al transgenelor în compoziția vectorilor reți-ruși nu depășește 8000 de perechi de baze de acid nucleic.
Principalele probleme de aplicare ARN Virus Vectors. - livrarea eficientă a materialului genetic în celule, suport pentru exprimarea pe termen lung și transducția celulelor non-detectivi (majoritatea vectorilor ARN sunt incapabili de transferul efectiv al transgențelor în celulele de odihnă). Cu toate acestea, incapacitatea retrovirusurilor la transducția celulelor de odihnă într-o anumită situație poate fi, de asemenea, avantajoasă, de exemplu, în terapia genică a lui Glioblast (tumorile creierului malign). Ideea utilizării lor constă în transducția electorală a celulelor divizate în centrul leziunilor - celulele tumorale și celulele vaselor; Celulele nervoase nu sunt împărțite și, prin urmare, nu servesc ținta vectorilor retrovirali.
Vectori bazați pe virușii genomici ADN
Vectoricreate pe baza Virusurile ADN Acestea au dimensiuni mari comparativ cu virusurile genomului ARN și, prin urmare, pot găzdui fragmente de ADN (transgene) până la 35.000 de perechi de bază.
Adenovirus vectori. Pe baza adenovirusurilor, sunt create vectori pentru terapia genică în fibră de fibră și tumori maligne. Vectorii adenovirali sunt capabili de o transducție foarte eficientă a unui spectru mare de tipuri de celule umane, inclusiv celule nevăzute. Atenție specială merită vectori bazați pe virusul adenați. Virusul asociat adeninei este un virus non-optogenic, o persoană răspândită (la AG pe care o detectează la 80% din oameni). Virusul tropen la o anumită parte a genomului este integrat în principal cu un umăr scurt de cromozom 19. Experimentele arată eficacitatea vectorilor creați pe baza virusului adenorasoic, în transducția celulelor creierului, mușchii scheletici și ficatul.
Alte virusuri genomice ADN. Printre virusurile care conțin ADN-ul rămase relativ adesea o varietate de herpes (WSV), care manifestă faptul că Tropiness la țesutul nervos (în consecință este utilizat pentru transducția celulelor creierului).
Vectorii nevivari
Vectorii nevivari (Moleculele ADN cu proprietăți de transpospune sau secvențe de inserție) sunt mai puțin frecvente decât vectorii pe bază de viruși. Cu toate acestea, nici un vector viral nu au multe avantaje, cum ar fi siguranța și simplitatea designului. Prin construirea unui sistem sintetic pentru livrarea genelor în interiorul celulei, poate fi evitată riscul producerii unui virus recombinant sau a altor efecte toxice.
