REACȚIE DE PREZIPITARE GEL, RPG
(test de precipitare pe gel)

O metodă de detectare a antigenelor și anticorpilor bazată pe difuzarea componentelor printr-un strat de gel de agar (agaroză) și formarea unui precipitat vizibil în zonele în care se creează concentrațiile echivalente ale acestora.

Metoda cea mai des folosită este dubla (contra) difuzie, propusă de O. Ukhterloni în 1948, în care antigenele și serurile sunt introduse în godeuri opuse decupate în placa de gel; după un anumit timp, în grosimea gelului se formează benzi de precipitare, în funcție de numărul de antigeni și anticorpi de aceeași specificitate. În plus, metoda permite compararea mai multor antigeni între ei cu un anumit ser standard: dacă sunt identici, benzile de precipitare formate de ei se contopesc într-o linie continuă și, dimpotrivă, benzile se intersectează dacă antigenele comparate au diferențe ( așa-numitul fenomen „pinteni”)... Un alt avantaj al RPG este că amestecurile de antigene pot fi separate prin viteze de difuzie diferite și detectate individual; din același motiv, inhibitorii de precipitare pot fi, de asemenea, separați dacă sunt conținuti în materialul de testat. Dezavantajul metodei este considerat sensibilitatea sa scăzută, în caz contrar, rezoluția. RPG a fost utilizat pe scară largă ca test pentru detectarea antigenelor virusului hepatitei B și a anticorpilor împotriva acestora în anii 60 - 70, în special, cu ajutorul acestei reacții, prezența unui e-antigen sau

PRECIPITARE(lat. praecipitatio cădere rapidă) - o reacție imunologică de precipitare dintr-o soluție a unui complex antigen-anticorp format ca urmare a combinării unui antigen solubil (precipitinogen) cu anticorpi specifici (precipitine).

Reacția lui P. este utilizată pe scară largă pentru identificarea și determinarea cantitativă a celor mai diverși antigeni și anticorpi (vezi. Imunodiagnostic), la serodiagnostic inf. boli (vezi. Studii serologice), pentru detectarea impurităților din alimente, în studiul relațiilor de evoluție în lumea animală și vegetală, în studiul structurii diferitelor bioli, compuși, în medicina legală pentru determinarea speciilor de sânge pete si alte bioluri, lichide.

P. a fost descoperit în 1897 de T. Kraus (R. Kraus), care a observat precipitarea (precipitatul) atunci când filtratele acelulare transparente din culturi de bulion de ciume, holeră și bacterii tifoide au fost amestecate cu ser imun omolog. În 1899 F. Ya. Chistovici, imunizând iepurii cu ser de anghilă, a primit anticorpi precipitanți și astfel a demonstrat pentru prima dată specificitatea de specie a proteinelor din serul sanguin. cererea lui P. în instanță.- dragă. examinarea pentru determinarea speciei de sânge a fost propusă în 1901 de P. Ulengut. Reacția se numește reacția Chistovici-Ulengut. Ulterior, s-a demonstrat că anticorpii precipitanți (vezi) se formează la reprezentanții diferitelor specii de vertebrate la orice substanțe străine cu molecul înalt (vezi. Antigene). Anticorpii de precipitare aparțin imunoglobulinelor de clasă G și M (vezi Imunoglobuline). Viteza și intensitatea biosintezei anticorpilor precipitanți sunt determinate de o serie de factori: doza și introducerea antigenului, schema de imunizare, caracteristicile substanței chimice. structura antigenului și caracteristicile genetice ale organismului imunizat.

Sunt utilizate diferite regimuri de imunizare pentru a obține seruri precipitante. Schemele mai multor cicluri de imunizare dau rezultate bune, fiecare dintre acestea incluzând mai multe injecții intravenoase sau intramusculare de antigen în cantități crescânde. În 1915, M. I. Raisky a propus o schemă constând din imunizare primară și reimunizare pe termen lung. Pe acest principiu se bazează producția de seruri cu titru ridicat precipitat. Se obișnuiește să se efectueze imunizarea primară cu un antigen amestecat cu o substanță de depunere (lanolină, ulei mineral, alaun de potasiu etc.), care sporește răspunsul imun și reimunizarea pe termen lung - numai cu un antigen. Adjuvantul Freund (amplificator), constând dintr-un amestec de uleiuri minerale și Mycobacterium tuberculosis ucis, este utilizat pe scară largă ca substanță de depunere (vezi Adjuvanți).

O soluție de antigen, emulsionată într-un volum egal de adjuvant Freund, se administrează animalelor de experiență subcutanat sau intramuscular în mai multe puncte ale spatelui sau în permpoanele picioarelor posterioare sau în limfa poplitee. nodurile membrelor posterioare. Unele regimuri utilizează combinații ale căilor de administrare enumerate. O lună mai târziu, animalelor li se injectează soluție de antigen intravenos sau intramuscular. Dacă este necesar, înainte de reimunizare, hiposensibilizarea se efectuează conform Bezredka (vezi. Metodele Bezredka). Cu un consum nesemnificativ de antigen (1-3 mg pentru antigenele proteice în cursul imunizării), cantitatea de anticorpi formată ajunge la câteva miligrame în 1 ml de ser imunitar.

Reacția de precipitare se caracterizează prin specificitate ridicată. Într-o serie de lucrări ale lui K. Landsteiner cu antiseruri la antigeni conjugați, ale căror grupe determinante erau diverși radicali organici, s-a demonstrat că în reacția lui P. se pot diferenția stereoizomerii compușilor organici. Puterea reacțiilor încrucișate observate este determinată de apropierea substanței chimice. structuri ale grupurilor determinante de imunoantigene și antigene de testare. Compoziția precipitatului include antigene și anticorpi specifici acestora și practic nu sunt incluse alte proteine ​​din serul sanguin, cu excepția complementului.

P. este o reacție foarte sensibilă. Cu ajutorul acestuia, pot fi detectate zecimi de microgram de antigen. La determinarea anticorpilor, pragul de sensibilitate de reacție este de cca. 20 mcg de proteine. Sensibilitatea reacției este semnificativ crescută dacă sunt utilizați antigeni sau anticorpi marcați cu izotopi radioactivi (vezi).

Setarea reacției

La stabilirea unei reacții de precipitare, este necesar să se țină cont de natura sa zonală, care se exprimă prin faptul că compoziția moleculară și cantitatea de precipitat format sunt determinate de raportul dintre antigen și anticorpi introduși în reacție (vezi Antigen – reactie anticorp). Când se utilizează o cantitate constantă de antiser și cantități crescânde de antigen, cantitatea de precipitat dintr-un rând de tuburi crește mai întâi, atinge un maxim și apoi scade până când dispare complet. Anticorpii liberi sunt detectați în supernatantul primelor tuburi (zona de anticorpi în exces), în lichidul deasupra precipitatului maxim, nu sunt conținute nici anticorpi liberi, nici antigen liber (zona de echivalență), complexe imune solubile și antigen liber (zona de exces). antigen) se găsesc în supernatantul ultimelor tuburi... Formarea complexelor imune solubile cu greutate moleculară mică în zona antigenului în exces este caracteristică tuturor sistemelor de precipitare în care anticorpii aparțin IgG. Prin urmare, această zonă de reacție este numită zonă de întârziere sau post-zonă. Trebuie remarcat faptul că complexele imune de antigene cu anticorpi IgM sunt insolubile într-un exces foarte mare de antigen, de zeci de ori mai mare decât cantitatea suficientă a acestuia pentru formarea complexelor imune solubile cu anticorpii IgG.

Pentru serurile antiproteice de cal, formarea complexelor imune solubile este caracteristică și în zona de exces de anticorpi, adică formarea unei prozone (vezi fenomenul Neisser-Wexberg). Această caracteristică a reacției a fost descoperită pentru prima dată de G. Ramon în sistemul toxină difteric - ser antitoxic de cal (vezi. Floculare). Dizolvarea complexelor imune în zona excesului de anticorpi a fost observată ulterior în timpul P. cu ser din sânge de iepure și câine împotriva albuminei serice de bovine, cu ser din sânge uman împotriva tiroglobulinei, antiser de oaie împotriva polipeptidelor sintetice.

Compoziția moleculară a precipitatului este de asemenea determinată de mol. greutatea (masa) antigenului. Pentru albumina de ou, spun ei. greutate to-rogo 42 000 daltoni, în zona de echivalență pe o moleculă de antigen există în medie 2,5 molecule de anticorpi. Cu o creștere a debarcaderului. greutatea antigenului, numărul de molecule de anticorpi legate de o moleculă de antigen crește.

Elementul este utilizat pentru determinarea calitativă și cantitativă a antigenelor și anticorpilor. O metodă calitativă rapidă, simplă și sensibilă a P. - precipitarea inelului, propusă în 1902 de Ascoli. Precipitarea inelară este utilizată pentru a identifica antigenele solubile ale microorganismelor. Reacția se realizează în eprubete înguste sau capilare, stratificând cu grijă soluția de antigen pe serul imunitar. Cu o reacție pozitivă, la interfața dintre cele două lichide apare un inel de precipitare. Rezultatul reacției nu este afectat de un exces de antigen datorită difuzării treptate a reactivilor la interfața lichidă. Dacă sunt folosite ca antigene extracte apoase fierte și filtrate de organe sau țesuturi, atunci reacția se numește „precipitare termică” (vezi reacția Ascoli). Termoprecipitarea este utilizată pentru a detecta antigenele bacteriene termostabile (coctoantigene) în țesuturile și organele animalelor moarte în timpul diagnosticului de ciume, holeră și antrax. Precipitarea inelară și precipitarea termică sunt efectuate cu antiseruri cu titru ridicat.

Metodele de evaluare a tăriei serurilor și a cantității de antigene prin diluția lor limitativă, care dă încă vizibil P. cu un antigen sau antiser standard, precum și metodele de proporții optime pot fi atribuite metodelor semicantitative ale P.

La titrarea serurilor la diluția limitativă, este necesar să se selecteze o astfel de cantitate de antigen pentru a nu cădea în zona de retenție. Prin urmare, se determină preliminar cea mai mică diluție a antigenului de testat, atunci când are loc o reacție cu ser evident pozitiv. Această diluție de lucru (doză) de antigen este utilizată pentru a determina diluția limitativă (titrul) serurilor testate. Titrarea comparativă a antigenului prin metoda de diluare limitativă poate fi efectuată fără selectarea prealabilă a dozei de lucru de ser, dacă acesta conține anticorpi de tip precipitant, dar nu de tip floculant.

Metoda proporțiilor optime se bazează pe determinarea punctului de echivalență al serolului. sisteme pe I. iniţial şi pe observaţia că punctul de echivalenţă în fiecare serol. sistem apare la un anumit raport dintre anticorpi și antigen. Prin urmare, la titrarea serurilor, după ce s-a determinat prin viteza lui P. cantitatea de antigen standard corespunzătoare punctului de echivalență, este posibil să-și exprime activitatea în orice biol condiționat. unități, dacă în titrarea preliminară cu ser de putere cunoscută se stabilește câte dintre unitățile sale sunt echivalente cu antigenul standard. Calcule similare sunt efectuate la titrarea antigenului cu ser standard. Metoda proporțiilor optime poate fi realizată în varianta a, propusă de Dean și Webb (H. Dean, R. Webb, 1928), - cu un volum constant de ser și diluții crescânde ale antigenului și în varianta ß. , propus de G. Ramon (1922), - cu un volum constant de antigen și diluții serice crescătoare.

Metoda cantitativă de determinare a anticorpilor în unități de greutate, propusă în 1933 de Heidelberger (M. Heidelberger) și Kendall (FE Kendall), se bazează pe faptul că în zona de echivalență aproape toți antigenul și toți anticorpii precipită din soluție. . După ce am definit orice substanță chimică. folosind metoda cantității de proteină precipitată în acest punct și scăzând din aceasta cantitatea de antigen adăugată la probă, se calculează cantitatea de proteină din precipitat atribuită proporției de anticorpi.

La declarația lui P. oricare dintre metodele descrise ar trebui să funcționeze cu soluții bine centrifugate de antigeni și seruri. Reacția trebuie însoțită de control: ser imun + soluție izotonică de clorură de sodiu, ser normal + antigen, ser heterolog + antigen. Este necesar să se prevină posibilitatea contaminării bacteriene prin efectuarea P. în condiții sterile sau folosind conservanți precum mertiolat, amidă de sodiu. Reacția se realizează cu fiziol. concentrația de sare (soluție de clorură de sodiu 0,15 M), în intervalul pH 6,5-8,0.

Determinarea antigenelor individuale în amestec cu alte substanțe este posibilă în reacția lui P. numai când se utilizează seruri monospecifice. Anticorpii specifici din seruri pot fi identificați dacă P. se efectuează cu antigene individuale. Pentru analiza, caracteristicile și compararea sistemelor multicomponente antigen - anticorpi fără fracționarea lor preliminară, utilizați metode bazate pe efectuarea P. într-un gel, în special, metoda imunodifuziei duble conform Ouchterlon (vezi.Imunodifuzie).

P. este o reacție în două faze. Fazele reacției diferă în mecanismul și viteza de curgere (vezi. Reacția antigen-anticorp). Trebuie avut în vedere faptul că a doua fază a reacției - formarea precipitatului în sine - este influențată de o serie de factori nespecifici: concentrația de săruri și ioni de hidrogen în soluție, temperatura și volumul de reactivi. Odată cu creșterea concentrației de săruri peste fiziol, valoarea (0,15 M), cantitatea de precipitat formată scade. În soluție de clorură de sodiu 15% precipitatele formate din antigenele polizaharide se disociază. Modificarea concentrației ionilor de hidrogen în fiziol. în intervalul de pH (de la 6,5 ​​la 8,0) nu afectează semnificativ formarea precipitatului. Cu o scădere a pH-ului soluției la 5,0 sau o creștere la 9,0, cantitatea de precipitat formată scade semnificativ, iar la pH sub 3,0 și peste 11,0, precipitatele formate anterior se disociază. Metodele de izolare a anticorpilor puri și a antigenelor din precipitate specifice se bazează pe proprietatea precipitatelor de a se disocia în soluții de sare puternică și la valori extreme ale pH-ului. Cei mai folosiți agenți de disociere sunt soluțiile concentrate de săruri neutre, diluate la tine și alcaline, soluțiile concentrate de amide, polianioni.

Precipitații criminalistice

În medicina legală, P. este folosit pentru a diferenția sângele oamenilor și al animalelor (vezi Sânge). Cea mai răspândită este precipitarea inelului, dar nu este potrivită pentru studiul soluțiilor de antigen tulbure și este supusă efectelor nespecifice de contaminare a obiectului examinat. P. în gel de agar este lipsit de aceste dezavantaje, totuși necesită perioade lungi de observație și este mai puțin sensibil. Introduceți în practică electroprecipitarea, sau contrare imunoelectroforeza (vezi), combinând avantajele lui P. în agar cu sensibilitate ridicată și viteza reacției. Toate opțiunile lui P. sunt efectuate cu seruri imune (vezi) proteine ​​care precipită la o persoană, un câine, un cal etc. Ele trebuie să fie active și specifice, adică să cauzeze P. unui antigen omolog (de exemplu, corespunzătoare ser normal de sânge uman sau un animal) și nu formează un precipitat cu antigene heteroloage (străine).

Extractele sunt preparate din petele de sânge aflate în cercetare și diluate până la concentrația necesară de proteine. Pentru P. în agar, puteți lua tăieturi (extrase) din pete și efectuați o reacție cu mai multe seruri de precipitare. În același timp, se testează secțiunile de control ale subiectului - purtătorul petelor, care nu ar trebui să provoace P. -. sângele unei persoane, câine etc. În acest caz, este imposibil să se stabilească cu exactitate originea sângelui dacă aparține unor animale strâns înrudite (de exemplu, sângele unui câine sau al unui lup). Un rezultat negativ în prezența proteinei în extract indică faptul că sângele aparține animalului, a cărui proteină nu este detectată folosind setul obișnuit de seruri precipitante. Dacă nu este detectată nicio proteină în extract, atunci se ia în considerare doar un rezultat pozitiv, deoarece absența precipitatului poate fi explicată printr-o cantitate insuficientă de proteine ​​în extract.

Bibliografie: Boyd W. Fundamentals of immunology, trad. din engleză, p. 314, M., 1969; Cabot E. și Meyer M. Imunochimie experimentală, trad. din engleză, p. 8 etc., M., 1968; Raysky M. Producția rapidă de precipitine puternice, Harkov. Miere. zhurn., t. 20, nr.8, p. 135, 1915; el, Reimunizarea, ca metodă de obţinere a serurilor precipitante, ibid., p. 142; el, Cât timp persistă precipitinele puternice în sângele unui animal imunizat, ibid., nr.9, p. 161; el, Cum este necesar să se imunizeze astfel încât animalul să păstreze stabil și pentru o lungă perioadă de timp precipitine puternice în sânge, ibid., p. 169; Tumanov A.K. Fundamentele examinării medico-legale a probelor materiale ^ p. 57, M., 1975; Charny VI Stabilirea specificității de specie a proteinelor din sânge, M., 1976; Chistovici F. Ya. Modificări ale proprietăților sângelui la injectarea de ser și sânge străin, în legătură cu teoria imunității Ehrlich'a, Rus. arc. patol., pană, miere. şi bact., v. 8, c. 1, p. 21, 1899; C un domnul intra Ph. L. Imunologie și serologie, Philadelphia, 1975; Metode în imunologie și imunochimie, ed. de C. A. Williams a. M. W. Chase, v. 3, N. Y. - L., 1971.

I. A. Tarhanova; V.I. Charny (curte).

În reacția de precipitare, precipită un complex imun specific, constând dintr-un antigen solubil (lizat, extract, haptenă) și un anticorp specific în prezența electroliților.

Inelul tulbure sau precipitatul rezultat se numește precipitat. Din reacția de aglutinare, această reacție diferă în principal prin dimensiunea particulelor de antigen.

Reacția de precipitare este utilizată de obicei pentru determinarea antigenului în diagnosticul unui număr de infecții (antrax, meningită etc.); în medicina legală - pentru a determina speciile de sânge, spermatozoizi etc.; in cercetarea sanitara si igienica - la stabilirea falsificarii produselor; cu ajutorul ei se determină relația filogenetică dintre animale și plante. Pentru reacție aveți nevoie de:

1. Anticorpi (precipitine) - ser imunitar cu un titru ridicat de anticorpi (nu mai puțin de 1: 100000). Titrul serului precipitant este determinat de cea mai mare diluție a antigenului cu care reacționează. Serul este utilizat de obicei nediluat sau într-o diluție de 1:5 - 1:10.

2. Antigen - substanțe dizolvate de natură proteică sau lipoid-polizaharidă (antigene și haptene complete).

3. Soluție izotonică.

Principalele metode de realizare a reacției de precipitare sunt reacția de precipitare în ciclu și reacția de precipitare în agar (gel).

Atenţie! Toate componentele implicate în reacția de precipitare trebuie să fie complet transparente.

Reacția de precipitare inelară... În tubul de precipitare se adaugă 0,2-0,3 ml (5-6 picături) de ser cu ajutorul unei pipete Pasteur (serul nu trebuie să cadă pe pereții tubului). Antigenul este stratificat cu grijă pe ser în același volum, turnându-l cu o pipetă Pasteur subțire de-a lungul peretelui eprubetei. În același timp, eprubeta este ținută în poziție înclinată. Cu o stratificare adecvată, ar trebui să se formeze o graniță clară între ser și antigen. Puneți eprubeta într-un suport cu grijă pentru a nu amesteca lichidele. Dacă reacția este pozitivă, se formează un „inel” tulbure la marginea antigenului și a anticorpului - un precipitat (vezi Fig. 48).

Reacția este urmată de un număr de controale (Tabelul 18). Secvența de adăugare a ingredientelor de reacție în eprubetă este foarte importantă. Este imposibil să așezați serul pe antigen (în control - pe soluția izotonă), deoarece densitatea relativă a serului este mai mare, se va scufunda în fundul eprubetei, iar granița dintre lichide nu se va așeza. fi dezvăluit.

Tabelul 18. Schema de stadializare a reacției de precipitare în ciclu

Notă. + prezența unui „inel”; - lipsa unui „inel”.

Rezultatele se înregistrează după 5-30 de minute, în unele cazuri după o oră, ca întotdeauna, începând cu controalele. „Inelul” din a 2-a eprubetă indică capacitatea serului imun de a intra într-o reacție specifică cu antigenul corespunzător. Nu ar trebui să existe „inele” în eprubetele 3-5 - nu există anticorpi și antigeni corespunzători. Un „inel” în prima eprubetă - un rezultat pozitiv al reacției - indică faptul că antigenul testat corespunde serului imun prelevat, absența unui „inel” (un „inel” doar în a 2-a eprubetă) indică acestea. discrepanță - un rezultat negativ al reacției.

Reacția de precipitare cu agar (gel).... Particularitatea reacției este că interacțiunea dintre antigen și anticorp are loc într-un mediu dens, adică într-un gel. Precipitatul rezultat dă o bandă tulbure în cea mai mare parte a mediului. Absența unei benzi indică o nepotrivire între componentele reacției. Această reacție este utilizată pe scară largă în cercetarea biomedicală, în special în studiul formării toxinelor în agentul cauzal al difteriei.

Întrebări de control

1. Care este principala diferență dintre reacțiile de aglutinare și de precipitare?

2. De ce nu pot fi folosite ingrediente tulburi în reacția de precipitare?

Exercițiu

1. Puneți pe inel reacția de precipitare și schițați rezultatul.

2. Studiați natura interacțiunii antigenului cu anticorpul în reacția de precipitare în agar, schițați rezultatul (luați o ceașcă de la profesor).

Reacția de liză (citoliza imună)

Liza imună este dizolvarea celulelor sub influența anticorpilor cu participarea obligatorie a complementului. Pentru reacție aveți nevoie de:

1. Antigen - microbi, eritrocite sau alte celule.

2. Anticorp (lizina) - ser imunitar, mai rar serul pacientului. Serul bacteriolitic contine anticorpi implicati in liza bacteriilor; hemolitice - hemolizine, care favorizează liza eritrocitelor; pentru liza spirochetelor este nevoie de spirochetolysins, celule - itolysins etc.

3. Complement. Cea mai mare parte a complementului se află în serul cobaiului. Acest ser (un amestec de la mai multe animale) este folosit în mod obișnuit ca complement. Complementul proaspăt (nativ) este instabil și ușor distrus prin încălzire, agitare, depozitare, așa că îl puteți folosi nu mai mult de două zile după primire. Pentru a păstra complementul, i se adaugă acid boric 2% și sulfat de sodiu 3%. Acest complement poate fi păstrat la 4 ° C timp de până la două săptămâni. Complementul uscat este folosit mai des. Înainte de utilizare, se dizolvă într-o soluție izotonă până la volumul inițial (indicat pe etichetă).

4. Soluție izotonică.

Reacția de hemoliză(Tabelul 19). Pentru reacție aveți nevoie de:

1. Antigen - 3% suspensie de eritrocite de berbec spălate în proporție de 0,3 ml sediment eritrocitar și 9,7 ml soluție izotonă.

2. Anticorp - ser hemolitic (hemolizină) împotriva eritrocitelor de oaie; preparat de obicei în producție, liofilizat și titrul este indicat pe etichetă.

Titrul de hemolizină este cea mai mare diluție a serului la care are loc hemoliza completă a suspensiei de 3% de eritrocite în prezența complementului. Pentru reacția de hemoliză, hemolizina este luată într-un titru triplu, adică este diluată de 3 ori mai puțin decât înainte de titru. De exemplu, cu un titru seric de 1: 1200, serul este diluat 1: 400 (0,1 ml de ser * și 39,9 ml de soluție izotonă). Este necesar un exces de hemolizină, deoarece o parte din aceasta poate fi adsorbită de alte componente ale reacției.

* (Nu luați mai puțin de 0,1 ml de ser - acuratețea măsurării are de suferit.)

3. Complementul se diluează 1:10 (0,2 ml de complement și 1,8 ml de soluție izotonă).

4. Soluție izotonică.

Tabelul 19. Schema reacției de hemoliză

Contabilitatea rezultatelor. Dacă reacția este setată corect, hemoliza va avea loc în prima eprubetă - conținutul acesteia va deveni transparent. La controale, lichidul rămâne tulbure: în a 2-a eprubetă există o lipsă de complement pentru apariția hemolizei, în a 3-a - nu există hemolizină, în a 4-a - nu există nici hemolizină, nici complement, în a 5-a - antigenul nu corespunde anticorpului,

Dacă este necesar, serul hemolitic este titrat conform următoarei scheme (Tabelul 20).

Înainte de titrare, se prepară diluția inițială a serului 1: 100 (0,1 ml ser și 9,9 ml soluție izotonică), din care se fac diluțiile necesare, de exemplu:

Din aceste diluții, se adaugă 0,5 ml de ser în eprubetele experimentului de titrare, așa cum se arată în tabel. douăzeci.

Tabelul 20. Schema de titrare a serului hemolitic (hemolizină)

În exemplul prezentat în tabel. 20, titrul serului hemolitic este 1: 1200.

Când se utilizează ser hemolitic proaspăt, acesta trebuie inactivat pentru a distruge complementul prezent în el. Pentru a face acest lucru, este încălzit timp de 30 de minute la 56 ° C într-o baie de apă sau într-un dezactivator cu termostat. Ultima metodă este mai bună: exclude posibilitatea supraîncălzirii zerului, adică denaturarea acestuia. Serurile denaturate nu sunt potrivite pentru testare.

Reacție de bacterioliză... În această reacție, complementul lizează bacteriile în prezența unui ser adecvat (omologul). Schema de reacție este fundamental similară cu schema de reacție de hemoliză. Diferența este că, după o incubare de două ore, toate tuburile sunt placate pe vase Petri cu un mediu favorabil microorganismului luat în experiment pentru a afla dacă este lizat. Cu un experiment setat corect, inoculările din 2-5 tuburi (martori) ar trebui să aibă o creștere abundentă. Absența creșterii sau creșterea slabă în inocularea din prima eprubetă (experiment) indică moartea microbilor, adică că aceștia sunt omologi cu anticorpul.

Atenţie! Reacția de bacterioliză trebuie efectuată în condiții aseptice.

Întrebări de control

1. Ce se întâmplă cu eritrocite dacă se folosește apă distilată în loc de soluție izotonică de clorură de sodiu? Ce se află în spatele acestui fenomen?

2. Ce reacție va avea loc atunci când eritrocitele interacționează cu serul imun omolog în absența complementului?

Exercițiu

Stabiliți o reacție de hemoliză. Capturați și schițați rezultatul.

În reacția de precipitare, precipită un complex imun specific, constând dintr-un antigen solubil (lizat, extract, haptenă) și un anticorp specific în prezența electroliților.

Un inel tulbure sau un precipitat format ca urmare a acestei reacții se numește precipitat... Din reacția de aglutinare, această reacție diferă în principal prin dimensiunea particulelor de antigen.

Reacția de precipitare este utilizată de obicei pentru determinarea antigenului în diagnosticul unui număr de infecții (antrax, meningită etc.); în medicina legală - pentru a determina speciile de sânge, spermatozoizi etc.; in cercetarea sanitara si igienica - la stabilirea falsificarii produselor; cu ajutorul ei se determină relația filogenetică dintre animale și plante. Pentru reacție aveți nevoie de:

1. Anticorpi (precipitine) - ser imunitar cu un titru ridicat de anticorpi (nu mai puțin de 1: 100.000). Titrul serului precipitant este determinat de cea mai mare diluție a antigenului cu care reacționează. Serul este folosit de obicei nediluat sau diluat 1:5 -1:10.

2. Antigen - substanțe dizolvate de natură proteică sau lipoid-polizaharidă (antigene și haptene complete).

3. Soluție izotonică.

Principalele metode de realizare a reacției de precipitare sunt reacția de precipitare în ciclu și reacția de precipitare în agar (gel).

Atenţie! Toate componentele implicate în reacția de precipitare trebuie să fie complet transparente.

Reacția de precipitare inelară.În tubul de precipitare se adaugă 0,2-0,3 ml (5-6 picături) de ser cu ajutorul unei pipete Pasteur (serul nu trebuie să cadă pe pereții tubului). Antigenul este stratificat cu grijă pe ser în același volum, turnându-l cu o pipetă Pasteur subțire de-a lungul peretelui eprubetei. În același timp, eprubeta este ținută în poziție înclinată. Cu o stratificare adecvată, ar trebui să se formeze o graniță clară între ser și antigen. Puneți eprubeta într-un suport cu grijă pentru a nu amesteca lichidele. Dacă reacția este pozitivă, se formează un „inel” tulbure la marginea antigenului și a anticorpului - un precipitat.

Reacția de precipitare cu agar(gel). Particularitatea reacției este că interacțiunea dintre antigen și anticorp are loc într-un mediu dens, adică în gel. Precipitatul rezultat dă o bandă tulbure în cea mai mare parte a mediului. Absența unei benzi indică o nepotrivire între componentele reacției. Această reacție este utilizată pe scară largă în cercetarea biomedicală, în special în studiul formării toxinelor în agentul cauzal al difteriei.

Reacția de liză (citoliza imună)

Liza imună- Aceasta este dizolvarea celulelor sub influența anticorpilor cu participarea obligatorie a complementului. Pentru reacție aveți nevoie de:

1. Antigenul- microbi, eritrocite sau alte celule.

2. Anticorp(lizina) - ser imunitar, mai rar serul pacientului. Serul bacteriolitic contine anticorpi implicati in liza bacteriilor; hemolitice - hemolizine, care favorizează liza eritrocitelor; liza spirochetelor necesită spirochetolysins, celule - itolysins etc.

3. Completa Cea mai mare parte a complementului se află în serul cobaiului. Acest ser (un amestec de la mai multe animale) este folosit în mod obișnuit ca complement.

4. Soluție izotonică.

Acest articol se va concentra asupra fenomenului reacției de precipitare. Aici vom lua în considerare trăsăturile enunțului acestui fenomen, fenomenul de difuzie, caracteristicile generale, rolul în viața umană și multe altele.

Familiarizarea cu fenomenul

Precipitația este un fenomen de tip serologic, în timpul căruia antigenele solubile interacționează cu anticorpii și, ca urmare, se observă precipitarea.
Caracteristica generală a reacției de precipitare este forma influenței coordonate a antigenului și anticorpului. Aceste tipuri de interacțiuni fac posibilă determinarea prezenței antigenelor necunoscute în substanța de testat prin adăugarea de anticorpi și antigeni cunoscuți. Procesul de precipitare fără prezența sărurilor va continua mai rău, iar cel mai bun optim se află în intervalul 7,0-7,4 pH.

Elementele constitutive ale reacției

Printre componentele reacției de precipitare se disting trei elemente principale:

1. Un antigen cu natură moleculară. Este într-o stare fin dispersată, cu alte cuvinte, este solubilă. Și, de asemenea, un astfel de antigen se numește precipitogen, care este un lizat sau extract de țesut etc. Un precipitogen are o diferență caracteristică față de aglutinogen, care constă în dimensiunea particulelor din care este compus. Aglutinogenul este dimensiunea inerentă a celulelor, iar precipitații sunt proporționali cu dimensiunea moleculei. Soluția de antigen este transparentă.
2. Un anticorp găsit în serul de sânge uman, precum și în serul de diagnostic imun, care conține anticorpii studiați.
3. Electroliții sunt soluții de clorură de sodiu, care se caracterizează printr-o stare izotonă.

Obținerea unui precipitatogen

Stabilirea unei reacții de precipitare este imposibilă fără un precipitatogen, care se obține prin măcinarea materialelor și extragerea antigenelor de natură proteică din acestea. Extracția are loc prin fierbere sau prin alte metode.
Un exemplu izbitor de precipitații sunt lizatele, precum și extractele de țesuturi și organe, serurile de sânge, diferite tipuri de filtrate pe bază de culturi de bulion de la microbi, precum și un extract de sare de microorganisme și substanțe autolizate.

Stadionarea în precipitații

Acum să luăm în considerare metoda de stabilire a reacției de precipitare.
Se efectuează o reacție de precipitare inelă, care are loc în eprubete special pregătite. Serul este introdus în cavitatea vasului, turnându-l de-a lungul peretelui folosind un vârf de pipetă. Apoi, cantitatea adecvată de precipitatogen este stratificată cu grijă deasupra, iar apoi eprubeta este adusă într-o poziție verticală de la una orizontală. Stabilirea și contabilizarea reacției de precipitare este o operație foarte meticuloasă. Rezultatul este luat în considerare după apariția unui inel alb la granița dintre antigen și anticorp. Dacă elementele de reacție ale reacției corespund între ele, atunci se leagă, dar acest lucru devine vizibil după o perioadă lungă de timp de interacțiune.
Reacția de precipitare se realizează și într-o cutie Petri sau pe o lamă de sticlă, unde se transferă gelul de agar, aplicându-l într-un strat mic. După ce s-a solidificat în gel, se decupează un număr mic de godeuri în care vor fi plasați antigene și anticorpi. Există două moduri de a face acest lucru: imunodifuzia radială și imunodifuzia dublă.

Informatii generale

Mecanica de precipitare este similară cu dispozitivul de aglutinare. Fiind expus influenței serului de tip imunitar, antigenul, care a intrat deja într-o reacție, își scade singur.O condiție importantă este transparența atât a serului, cât și a antigenului.
Este posibil să se îmbunătățească înregistrarea reacției dacă antigenele sunt stratificate pe anticorpi. În consecință, se poate observa apariția precipitatelor sub formă de inel. Acest fenomen se numește precipitare inelară și se realizează în tuburi speciale cu un diametru de 2,5 până la 3,5 mm. Unul dintre cele mai comune exemple de reacție de precipitare este diagnosticul de antrax.
Precipitația face posibilă determinarea nivelului de toxicitate al culturii de difterie în agar.
În cursul reacției luate în considerare, are loc precipitarea complexelor antigenice și a anticorpilor. Precipitația este un fenomen imunologic care vă permite să determinați cantitatea de anticorpi din serul sanguin al unei persoane bolnave sau vaccinate și al animalelor.

Efect de titrare

Este important de știut că datele obținute prin titrarea metodei de mai sus nu sunt cuantificabile. Pentru a crea și analiza o estimare cantitativă a numărului de anticorpi conținut, M. Heidelberger și E. Kabat au dezvoltat o metodă de reacție specială bazată pe căutarea și identificarea zonei de echivalență. Amestecarea numărului de antigene legat de vârstă cu o valoare constantă a volumului antiserului duce la o creștere a precipitatului format inițial, iar apoi scade din nou datorită creșterii capacității de a dizolva complexele antigene. Prin determinarea cantității de anticorpi din fluidele supernatante conținute în fiecare tub, se poate constata că nu va exista lichid într-un anumit număr de vase cu anticorpi. Aici, în comparație cu alte eprubete, se va forma cel mai mare precipitat. Datorită acestui fapt și scăderii precipitatului proteic antigenic din valoarea totală a proteinelor, este posibil să se obțină valoarea exactă a anticorpilor conținuti în volumul serului investigat în mod specific. Mai mult, cantitatea de molecule proteice din precipitat este determinată de cantitatea de azot sau folosind metode colorimetrice.

Estimarea valorilor

Evaluarea valorilor precipitațiilor în metodologia de diagnostic ar trebui să țină cont de probabilitatea prezenței în serul imunitar a unui anticorp care nu are proprietatea precipitinei, din care rezultă că precipitatul în sine nu se poate forma după reacția cu antigenele. Lista acestor molecule include anticorpi incompleti și unele specii din grupul globulinelor gamma-A.

Reacția de precipitare în condiții de laborator își găsește aplicarea în diferite tipuri de modificări. De exemplu, reacția de precipitare termică este utilizată pentru a detecta antigenele bacteriene de botulism, antrax etc., care nu sunt supuse denaturarii termice. Spre deosebire de precipitarea inelară, acest tip de reacție folosește filtratele materialului în cauză în stare de fierbere.
precipitarea într-un amestec complex nu permite caracterizarea proprietăților elementelor individuale ale amestecului. În astfel de cazuri, o persoană recurge la metoda de precipitare în agar și utilizează, de asemenea, imunoelectrofereză.

Precipitații difuze

În acest domeniu de cercetare, există conceptul de reacție a precipitațiilor difuze (RPD). Se bazează pe capacitatea anticorpilor și a antigenelor solubile de a difuza în gel. Difuzia este capacitatea unei molecule dintr-o anumită substanță de a pătrunde în moleculele alteia, care este cauzată de mișcarea termică.
Gelul este un sistem de tip dispersat în care faza lichidă este distribuită uniform în faza solidă. Cel mai adesea, pentru această reacție se folosește un gel de agar.
După stabilirea parametrilor sub care moleculele pot difuza unele în raport cu altele, întâlnirea lor va fi însoțită de formarea unui complex antigen + anticorp. Un astfel de neoplasm este capabil să difuzeze în timp ce se află în gel și va precipita, luând forma unei benzi care poate fi detectată cu ochiul liber. În cazul omologiei dintre antigen și anticorp, nu se va forma nicio bandă.
Crearea condițiilor în care va avea loc difuzia, aflându-se în stratul de agar, presupune umplerea componentelor, dar numărul total de godeuri și aranjarea lor reciprocă este determinat de tipul de problemă care trebuie rezolvată. RPD permite unei persoane să detecteze și să identifice viruși izolați necunoscuti prin cercetare folosind ser cu anticorpi cunoscut.

Aplicație

Precipitația este utilizată pe scară largă nu numai în diagnosticarea bolilor, dar își găsește aplicarea și în examinarea medicală legală. Este greu de imaginat o analiză în care să fie posibilă determinarea speciei de sânge, a unei părți a unui organ sau a unui țesut găsită pe un instrument criminal, în care reacția de precipitare nu este utilizată. In timpul acestui proces se folosesc seruri precipitante care se obtin prin imunizarea diferitelor animale si pasari. Este important ca nivelul titrului seric să fie de cel puțin 1: 10.000 și, de asemenea, trebuie să aibă suficientă specificitate. Din bucățile de sânge detectate sau crusta sa, se face un extract pentru fizic. soluție, care va fi expusă în continuare serului precipitant. Conform acestei reacții, este posibil să se stabilească tipurile de proteine ​​​​de țesut și organ atât ale oamenilor, cât și ale animalelor. Obținerea extractelor tulburi obligă să recurgă la precipitarea pe agar.

concluzii

Analizând informațiile citite, putem concluziona că reacțiile de precipitare sunt extrem de importante pentru oameni, deoarece permit diagnosticarea diferitelor antigene cu ajutorul anticorpilor, acest fenomen fiind utilizat pe scară largă și în examenele medico-legale și vă permite să identificați tipul de sânge, țesut sau organ din raport cu un anumit subiect. Există mai multe tipuri și metode de precipitare care sunt utilizate în conformitate cu nevoile emergente ale problemei care se rezolvă.