Реакция преципитации (иммунологический метод). Преципитации реакция Реакции антиген-антитело и их применение

19.07.2019

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ, РПГ
(Gel precipitation test)

Метод выявления антигенов и антител, основанный на диффузии компонентов через слой агарового (агарозного) геля и образования видимого преципитата на участках, где создаются их эквивалентные концентрации.

Чаще всего используется метод двойной (встречной) диффузии, предложенный О. Ухтерлони в 1948 г., при котором антигены и сыворотки вносятся в противостоящие лунки, вырезанные в пластинке геля; через определенное время в толще геля образуются преципитационные полосы, соответственно числу антигенов и антител совпадающей специфичности. Кроме того, метод позволяет проводить сравнение нескольких антигенов между собой при некой стандартной сыворотке: в случае их идентичности образуемые ими полосы преципитации сливаются в сплошную линию и, наоборот, полосы пересекаются, если сравниваемые антигены имеют различия (т. н. феномен “шпоры”). Другим преимуществом РПГ является то, что смеси антигенов могут разделяться за счет разной скорости диффузии и выявляться индивидуально; по этой же причине могут отделяться и ингибиторы преципитации, если они содержатся в испытуемом материале. Недостатком метода считают его низкую чувствительность, иначе, разрешающую способность. РПГ широко использовалась как тест на обнаружение антигенов вируса гепатита В и антител к ним в 60 - 70-е годы, в частности, с помощью этой реакции было установлено наличие в составе вируса е-антигена или

ПРЕЦИПИТАЦИЯ (лат. praecipitatio стремительное падение) - иммунологическая реакция осаждения из раствора комплекса антиген-антитело, образующегося в результате соединения растворимого антигена (преципитиногена) со специфическими антителами (преципитинами).

Реакцию П. широко используют для идентификации и количественного определения самых разнообразных антигенов и антител (см. Иммунодиагностика), при серодиагностике инф. болезней (см. Серологические исследования), для обнаружения примесей в пищевых продуктах, при изучении эволюционных взаимосвязей в животном и растительном мире, при исследовании структуры различных биол, соединений, в судебной медицине для определения видовой принадлежности пятен крови и других биол, жидкостей.

П. открыта в 1897 т. Краусом (R. Kraus), наблюдавшим выпадение осадка (преципитата) при смешивании бесклеточных прозрачных фильтратов бульонных культур бактерий чумы, холеры, тифа с гомологичными иммунными сыворотками. В 1899 г. Ф. Я. Чистович, иммунизируя кроликов сывороткой угря, получил преципитирующие антитела и тем самым впервые продемонстрировал видовую специфичность белков сыворотки крови. Применение П. в суд.-мед. экспертизе для определения видовой принадлежности крови было предложено в 1901 г. П. Уленгутом. Реакция получила название реакции Чистовича - Уленгута. Впоследствии было показано, что преципитирующие антитела (см.) образуются у представителей различных видов позвоночных к любым чужеродным высокомолекулярным веществам (см. Антигены ). Преципитирующие антитела принадлежат к иммуноглобулинам класов G и M (см. Иммуноглобулины). Скорость и интенсивность биосинтеза преципитирующих антител определяются рядом факторов: дозой и путем введения антигена, схемой иммунизации, особенностями хим. структуры антигена и генетическими особенностями иммунизируемого организма.

Для получения преципитирующих сывороток используют различные схемы иммунизации. Хорошие результаты дают схемы из нескольких циклов иммунизации, каждый из которых включает несколько внутривенных или внутримышечных инъекций антигена в возрастающих количествах. В 1915 г. М. И. Райский предложил схему, состоящую из первичной иммунизации и отдаленной реиммунизации. На этом принципе основано получение преципитирующих сывороток высокого титра. Первичную иммунизацию принято проводить антигеном в смеси с каким-либо депонирующим веществом (ланолином, минеральным маслом, алюмокалиевыми квасцами и др.), усиливающим иммунный ответ, а отдаленную реиммунизацию - только антигеном. Широко применяют в качестве депонирующего вещества адъювант (усилитель) Фрейнда, состоящий из смеси минеральных масел и убитых микобактерий туберкулеза (см. Адъюванты).

Раствор антигена, эмульгированный в равном объеме адъюванта Фрейнда, вводят экспериментальным животным подкожно или внутримышечно в несколько точек спины либо в подушечки задних лапок или в подколенные лимф. узлы задних конечностей. В некоторых схемах используют комбинации перечисленных способов введения. Через месяц животным вводят р-р антигена внутривенно или внутримышечно. При необходимости перед реиммунизацией проводят гипосенсибилизацию по Безредке (см. Безредки методы). При незначительном расходе антигена (1-3 мг для белковых антигенов на курс иммунизации) количество образующихся антител достигает нескольких миллиграммов в 1 мл иммунной сыворотки.

Для реакции преципитации характерна высокая специфичность. В серии работ К. Ландштейнера с антисыворотками к конъюгированным антигенам, в качестве детерминантных групп которых выступали различные органические радикалы, было продемонстрировано, что в реакции П. можно дифференцировать стереоизомеры органических соединений. Сила наблюдающихся перекрестных реакций определяется близостью хим. структуры детерминантных групп иммуноантигенов и тест-антигенов. В состав преципитата входят антигены и специфичные к ним антитела и практически не включаются другие белки сыворотки крови, кроме комплемента.

П.- высокочувствительная реакция. С ее помощью могут быть обнаружены десятые доли микрограмма антигена. При определении антител порог чувствительности реакции составляет ок. 20 мкг белка. Чувствительность реакции значительно повышается, если применяют антигены или антитела, меченные радиоактивными изотопами (см.).

Постановка реакции

При постановке реакции преципитации необходимо учитывать ее зональный характер, который выражается в том, что молекулярный состав и количество образующегося преципитата определяются соотношением введенных в реакцию антигена и антител (см. Антиген - антитело реакция). При использовании постоянного количества антисыворотки и возрастающих количеств антигена количество преципитата в ряду пробирок вначале увеличивается, достигает максимума, а затем уменьшается вплоть до полного исчезновения. В надосадочной жидкости первых пробирок обнаруживают свободные антитела (зона избытка антител), в жидкости над максимальным преципитатом не содержатся ни свободные антитела, ни свободный антиген (зона эквивалентности), в надосадочной жидкости последних пробирок находят растворимые иммунные комплексы и свободный антиген (зона избытка антигена). Образование растворимых иммунных комплексов с небольшим молекулярным весом в зоне избытка антигена характерно для всех преципитирующих систем, антитела в которых принадлежат к IgG. Эта зона реакции названа поэтому зоной задержки, или постзоной. Следует отметить, что иммунные комплексы антигенов с IgM-антителами нерастворимы в очень большом избытке антигена, в десятки раз превышающем его количество, достаточное для образования растворимых иммунных комплексов с IgG-антителами.

Для лошадиных противобелковых сывороток характерно образование растворимых иммунных комплексов и в зоне избытка антител, т. е. образование прозоны (см. Нейссера-Вексберга феномен). Эту особенность реакции впервые обнаружил Г. Рамон в системе дифтерийный токсин - антитоксическая лошадиная сыворотка (см. Флоккуляция). Растворение иммунных комплексов в зоне избытка антител наблюдали впоследствии при проведении П. с кроличьими и собачьими сыворотками крови против бычьего сывороточного альбумина, с человеческой сывороткой крови против тиреоглобулина, овечьей антисывороткой против синтетических полипептидов.

Молекулярный состав преципитата определяется также мол. весом (массой) антигена. Для яичного альбумина, мол. вес к-рого 42 000 дальтон, в зоне эквивалентности на одну молекулу антигена приходится в среднем 2,5 молекулы антител. С увеличением мол. веса антигена число молекул антител, связываемых одной молекулой антигена, увеличивается.

П. используют для качественного и количественного определения антигенов и антител. Быстрый, простой и чувствительный качественный метод П.- кольцепреципитация, предложенная в 1902 г. Асколи. Кольцепреципитацию применяют для идентификации растворимых антигенов микроорганизмов. Реакцию выполняют в узких пробирках или капиллярах, осторожно наслаивая р-р антигена на иммунную сыворотку. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется кольцо преципитации. На результат реакции не влияет избыток антигена благодаря постепенной диффузии реагентов к границе жидкостей. Если в качестве антигенов используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то реакция носит название «термопреципитация» (см. Асколи реакция). С помощью термопреципитации обнаруживают термостабильные бактериальные антигены (коктоантигены) в тканях и органах погибших животных при диагностике чумы, холеры, сибирской язвы. Кольцепреципитацию и термопреципитацию выполняют с антисыворотками высокого титра.

К полуколичественным методам П. могут быть отнесены методы оценки силы сывороток и количества антигенов по их предельному разведению, дающему еще видимую П. со стандартным антигеном или анти-сывороткой, и методы оптимальных пропорций.

При титровании сывороток по предельному разведению необходимо подбирать такое количество антигена, чтобы не попасть в зону задержки. Поэтому предварительно определяют наименьшее разведение тест-антигена, при к-ром происходит реакция с заведомо положительной сывороткой. Это рабочее разведение (дозу) антигена используют для определения предельного разведения (титра) испытуемых сывороток. Сравнительное титрование антигена методом предельных разведений можно проводить без предварительного подбора рабочей дозы сыворотки, если она содержит антитела преципитирующего, но не флоккулирующего типа.

Метод оптимальных пропорций основан на определении точки эквивалентности серол. системы по инициальной И. и на том наблюдении, что точка эквивалентности в каждой серол. системе возникает при определенном отношении антитела к антигену. Поэтому при титровании сывороток, определив по быстроте П. количество стандартного антигена, соответствующее точке эквивалентности, можно выразить ее активность в любых условных биол. единицах, если в предварительном титровании с сывороткой известной силы установлено, скольким ее единицам эквивалентен стандартный антиген. Аналогичные расчеты проводят при титровании антигена со стандартной сывороткой. Метод оптимальных пропорций может быть выполнен в a-варианте, предложенном Дином и Уэббом (H. Dean, R. Webb, 1928),- с постоянным объемом сыворотки и возрастающими разведениями антигена и в ß-варианте, предложенном Г. Рамоном (1922),- с постоянным объемом антигена и возрастающими разведениями сыворотки.

Количественный метод определения антител в весовых единицах, предложенный в 1933 г. Гейдельбергером (М. Heidelberger) и Кендаллом (F. Е. Kendall), основан на том, что в зоне эквивалентности из раствора в осадок выпадают практически весь антиген и все антитела. Определив любым хим. методом количество белка преципитата в этой точке и вычтя из него количество прибавленного в пробу антигена, рассчитывают количество белка в осадке, приходящееся на долю антител.

При постановке П. любым из описанных методов следует работать с хорошо отцентрифугированными р-рами антигенов и сывороток. Реакция должна сопровождаться контролем: иммунная сыворотка + изотонический р-р хлорида натрия, нормальная сыворотка + антиген, гетерологическая сыворотка + антиген. Следует предотвращать возможность бактериального загрязнения, выполняя П. в стерильных условиях или применяя консерванты типа мертиолата, амида натрия. Реакцию выполняют при физиол. концентрации соли (0,15 М раствор хлорида натрия), в диапазоне pH 6,5-8,0.

Определение индивидуальных антигенов, находящихся в смеси с другими веществами, возможно в реакции П. только при использовании моноспецифических сывороток. Специфические антитела в сыворотках могут быть идентифицированы, если П. выполняют с индивидуальными антигенами. Для анализа, характеристики и сравнения многокомпонентных систем антиген - антитело без их предварительного фракционирования используют методы, основанные на проведении П. в геле, в частности метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню (см. Иммунодиффузия) .

П.- двухфазная реакция. Фазы реакции отличаются по механизму и скорости протекания (см. Антиген-антитело реакция). Следует учитывать, что на вторую фазу реакции - собственно образование преципитата - оказывает влияние ряд неспецифических факторов: концентрация в растворе солей и водородных ионов, температура, объем реагентов. При увеличении концентрации солей выше физиол, значения (0,15 М) количество образующегося преципитата уменьшается. В 15% р-ре хлорида натрия преципитаты, образованные полисахаридными антигенами, диссоциируют. Изменение концентрации водородных ионов в физиол. пределах pH (от 6,5 до 8,0) заметно не влияет на формирование преципитата. При снижении pH раствора до 5,0 или повышении до 9,0 существенно уменьшается количество образующегося преципитата, а при pH ниже 3,0 и выше 11,0 ранее образованные преципитаты диссоциируют. На свойстве преципитатов диссоциировать в крепких солевых р-рах и при крайних значениях pH основаны методы выделения чистых антител и антигенов из специфических преципитатов. Наиболее употребляемые диссоциирующие агенты - концентрированные р-ры нейтральных солей, разбавленные к-ты и щелочи, концентрированные р-ры амидов, полианионы.

Преципитация в судебно-медицинском отношении

В судебной медицине П. применяют для дифференцирования крови человека и животных (см. Кровь). Наибольшее распространение получила кольцепреципитация, но она не пригодна для исследования мутных р-ров антигена и подвержена неспецифическим влияниям загрязнений объекта экспертизы. Этих недостатков лишена П. в агаровом геле, однако она требует длительных сроков наблюдения и менее чувствительна. Внедряют в практику электропреципитацию, или встречный иммуноэлектрофорез (см.), сочетающий достоинства П. в агаре с высокой чувствительностью и быстротой проведения реакции. Все варианты П. осуществляют с иммунными сыворотками (см.), преципитирующими белки человека, собаки, лошади и др. Они должны быть активны и специфичны, т. е. вызывать П. гомологичного антигена (напр., соответствующей нормальной сыворотки крови человека пли животного) и не образовывать преципитата с гетерологичными (чужеродными) антигенами.

Из исследуемых пятен крови готовят вытяжки и разводят их до необходимой концентрации белка. Для П. в агаре можно брать вырезки (вытяжки) из пятен и проводить реакцию с несколькими преципитирующими сыворотками. Параллельно испытывают контрольные участки предмета - носителя пятен, которые не должны вызывать П. При положительном результате с пятном крови и преципитирующей сывороткой делают вывод о видовой принадлежности крови, напр. кровь человека, собаки и др. При этом нельзя точно установить происхождение крови, если она принадлежит близкородственным животным (напр., кровь собаки или волка). Отрицательный результат при наличии в вытяжке белка свидетельствует о принадлежности крови животному, белок к-рого не выявляется с помощью обычного набора преципитирующих сывороток. Если в вытяжке не установлен белок, то принимают во внимание лишь положительный результат, т. к. отсутствие преципитата можно объяснить недостаточным количеством белка в вытяжке.

Библиография: Бойд У. Основы иммунологии, пер. с англ., с. 314, М., 1969; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., с. 8 и др., М., 1968; Райски й М. Быстрое получение крепких преципитинов, Харьковск. мед. журн.,т. 20, № 8, с. 135, 1915; он же, Повторная иммунизация, как метод получения преципитирующих сывороток, там же, с. 142; он же, Как долго сохраняются в крови иммунизированного животного крепкие преципитины, там же, № 9, с. 161; он же, Как нужно иммунизировать, чтобы животное устойчиво и длительно сохраняло в крови крепкие преципитины, там же, с. 169; Туманов А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств^ с. 57,М., 1975; Чарный В. И. Установление видовой специфичности белков крови, М., 1976; Чистович Ф. Я. Изменения свойств крови при впрыскивании инородной сыворотки и крови, в связи с теорией иммунитета Ehrlich’a, Рус. арх. патол., клин, мед. и бакт., т. 8, в. 1, с. 21, 1899; С а г-р enter Ph. L. Immunology and serology, Philadelphia, 1975; Methods in immunology and immunochemistry, ed. by C. A. Williams a. M. W. Chase, v. 3, N. Y.- L., 1971.

И. А. Тарханова; В. И. Чарный (суд.).

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.

* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).

4. Изотонический раствор.

Таблица 19. Схема реакции гемолиза

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).

Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.

Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.

Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом . От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 -1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат.

Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген -микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвуюищие в лизисе бактерий; гемолитическая- гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток- итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента.

4. Изотонический раствор .

Эта статья будет посвящена явлению реакции преципитации. Здесь мы рассмотрим особенности постановки данного явления, явление диффузии, общую характеристику, роль в жизни человека и многое другое.

Ознакомление с явлением

Преципитация - это явление серологического типа, в ходе которого происходит взаимодействие растворимых антигенов с антителами и вследствие этого наблюдается выпадение осадка - преципитата.
Общая характеристика реакции преципитации представляет собой форму согласованного влияния антигена и антитела. Такие типы взаимодействия позволяют определять наличие неизвестных антигенов в исследуемом веществе при помощи добавления известных антител и антигенов. Процесс преципитации без присутствия солей будет протекать хуже, а наилучший оптимум лежит в пределах диапазона от 7,0-7,4 pH.

Составные элементы реакции

Среди компонентов реакции преципитации выделяют три главных элемента:

Антиген, обладающий природой молекулярного характера. Он находится в состоянии мелкодисперсного типа, другими словами, он растворим. А также такой антиген называют преципитогеном, который является лизатом или экстрактом ткани и др. Преципитоген имеет характерное отличие от агглютиногена, которое заключено в размере частиц, из которых он состоит. Агглютиногену присущий размер клеток, а преципитогены соизмеряются с величиной молекулы. Раствор антигена характеризуется прозрачностью.
Антитело, находящееся в сыворотке человеческой крови, а также в иммунной диагностической сыворотке, которая содержит в себе изученные антитела.
Электролиты - это раствор хлорид натрия, которому свойственно изотоническое состояние.

Получение преципитогена

Постановка реакции преципитации невозможна без преципитогена, который получают при помощи измельчения материалов и извлекания из них антигенов белковой природы. Добывание происходит при помощи кипячения или других способов.
Ярким примером преципитогенов служат лизаты, а также тканевые и органные экстракты, сыворотки крови, разнообразные виды фильтратов, базирующихся на бульонных культурах из микробов, а также солевой экстракт микроорганизмов и аутолизатные вещества.

Постановка в преципитации

Теперь рассмотрим способ постановки реакции преципитации.
Производится кольцепреципитационная реакция, которая протекает в специально подготовленных пробирках. В полость посуды вносят сыворотку, разливая ее по стене при помощи носика пипетки. Далее, сверху аккуратно производят наслаивание соответствующего количества преципитогена, а потом пробирку приводят в вертикальное положение из горизонтального. Постановка и учет реакции преципитации - это весьма скрупулезные операции. Учет результата проводится после появления белого колечка на границе между антигеном и антителом. Если реагирующие элементы реакции соответствуют друг другу, то они связываются, но это становится заметным после продолжительного промежутка времени их взаимодействия.
Реакцию преципитации проводят также в чашке Петри или на предметном стекле, куда переносят агаровый гель, нанося его небольшим слоем. После его застывания в геле вырезают небольшое количество лунок, в которые будут помещены антигены и антитела. Существует два способа совершения подобного действия: метод радиальной иммунодиффузии и двойной иммунодиффузии.

Общие сведения

Механика работы преципитации схожа с устройством агглютинации. Подвергаясь влиянию сыворотки иммунного типа, антиген, уже вступивший в реагирование, уменьшает свою Важным условием является прозрачность как сыворотки, так и антигена.
Улучшить регистрацию реакции можно в том случае, если производить наслаивание антигенов на антитела. Вследствие этого можно наблюдать появление преципитатов в форме кольца. Это явление называется кольцепреципитацией и проводится в особых пробирках, имеющих диаметр от 2,5 до 3,5 мм. Одним из самых широко распространенных примеров реакции преципитации может служить диагностирование сибирской язвы.
Преципитация дает возможность определять уровень токсигенности дифтерийной культуры в агаре.
В ходе рассматриваемой реакции происходит осаждение антигенных комплексов и антител. Преципитация является иммунологическим феноменом, позволяющим определять количество содержания антител в сыворотках крови больного или вакцинированного человека и животных.

Следствие титрования

Важно знать, что данные, полученные путем титрования вышеупомянутого метода, не обладают количественным выражением. Чтобы создать и проанализировать количественную оценку содержащегося числа антител, была разработана М. Гейдельбергером и Е. Кабатом специальная методика реакции, в основе которой залегает поиск и выявление зоны эквивалентности. Смешивание возрастного числа антигенов с постоянной величиной объема антисыворотки приводит к возрастанию первоначально образующегося преципитата, а далее снова происходит его снижение вследствие увеличения способности к растворению комплексов антигена. Определив количество антител в надосадочных жидкостях, содержащихся в каждой пробирке, можно обнаружить, что в определенном числе посуды с антителами жидкость будет отсутствовать. Здесь будет образован, в сравнение с другими пробирками, самый большой преципитат. Благодаря этому и вычитанию из общей величины белков антигенного белкового преципитата, можно получить точную величину содержащихся антител в объеме конкретно исследуемой сыворотки. Далее, количество белковых молекул преципитата определяется по количеству азота или при помощи колориметрических методов.

Оценка значений

Оценка значений преципитации в диагностической методологии, должна учитывать вероятность наличия в иммунной сыворотке антитела, не обладающего свойством преципитина, из чего следует, что сам преципитат может не образоваться после реагирования с антигенами. В список таких молекул входят неполные антитела и некоторые виды из группы гамма-А-глобулинов.

Реакция преципитации в условиях лабораторий находит свое применение в разнообразных видах модификаций. Например, реакция термопреципитации применяется для выявления бактериальных антигенов ботулизма, сибирских язв и т. д., не подвергающихся денатурации термического типа. В отличие от кольцепреципитации, подобный тип реакции использует фильтраты рассматриваемого материала в прокипяченном состоянии.
преципитации в сложной смеси не позволяет давать характеристику свойствам отдельных элементов смеси. В таких случаях человек прибегает к методу преципитации в агаре, а также используют иммуноэлектроферез.

Преципитация диффузного характера

В данной области исследований существует понятие о реакции диффузной преципитации (РПД). Она основывается на способностях к диффузии в геле антител и растворяемых антигенов. Диффузия - это умение молекулы определенного вещества проникать в молекулы другого, что обуславливается тепловым движением.
Гель - это система дисперсного типа, в которой жидкостная фаза распределяется равномерным образом в твердой фазе. Чаще всего для такой реакции эксплуатируют гель агара.
После придания параметров, в условии которых молекулы смогут диффундировать по отношению друг к другу, их встреча будет сопровождаться образованием комплекса антигена + антитело. Такое новообразование способно диффундировать, находясь в самом геле, и оно будет выпадать в осадок, принимая вид полосы, которую можно обнаружить невооруженными глазами. В случае гомологичности антигена и антитела, полоса образовываться не будет.
Создание условий, в которых будет проходить диффузия, находясь в агаровом слое, предусматривает собой заливку компонентов, а вот общее число лунок и их взаиморасположение определяется типом задачи, которую необходимо решить. РПД дает человеку возможность обнаруживать и идентифицировать неизвестные выделенные вирусы при помощи исследования, с использованием заведомо известной сыворотки из антител.

Применение

Преципитация широко используется не только в диагностике заболеваний, но и находит свое применение в судебно-медицинской экспертизе. Сложно представить анализ, при котором можно определить видовую принадлежность крови, части органа или ткани, найденного на орудии преступления, в котором не используется реакция преципитации. В ходе данного процесса используют преципитирующие сыворотки, которые получают путем иммунизации различных животных и птиц. Важно, чтобы уровень титра в сыворотке был не меньше 1:10000, а также он должен обладать достаточной специфичностью. Из обнаруженного пятнышка крови или ее корочки изготавливают вытяжку на физ. растворе, которая в дальнейшем будет подвержена воздействию преципитирующей сыворотки. По данной реакции можно устанавливать виды тканевых и органных белков как человека, так и животного. Получение мутных вытяжек вынуждает прибегать к преципитации на агаре.

Выводы

Анализируя прочитанную информацию, можно заключить, что реакции преципитации крайне важны для человека, так как позволяют диагностировать различные антигены при помощи антител, также данное явление широко применяется в судебно-медицинской экспертизе и позволяет идентифицировать тип крови, ткани или органа по отношению к конкретному субъекту. Существует несколько видов и способов преципитации, которые используются в соответствии с возникающими потребностями решаемой задачи.