Культуральныйметод исследования представляет собой выделение из питательной средыбактерий определённого вида путём культивирования,с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.
Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой . После окончательной идентификации их характеристик, бактерии,выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.
Цель метода :
1. Этиологический диагноз, то есть выделение и идентификация чистой культуры бактерий.
2. Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.
3. Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей. Это необходимо для определения общности микроорганизмов выделенных в разных местах и разных условиях, что важно для эпидемиологических целей.
Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.
Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.
1 этап
А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение итранспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости отсвойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.
Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.
В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.
Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.
Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.
Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.
2 этап
А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности.Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.
Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре(для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).
Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:
· МПА
· 0,1% глюкозы
· 1% лактозы
· Специальный реактив на сероводород
· Феноловыйкрасный индикатор.
3 этап
А) Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.
Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.
Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).
В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.
Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.
Рис. Питательная среда Клиглера:
1 – исходная среда,
2 – рост E. coli,
3 – рост S. paratyphi B,
4 – рост S. Typhi.
E . coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.
S. paratyphi –
способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A-
не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B –
сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).
S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.
Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.
Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.
В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.
10385 0
Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.
В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.
К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:
- взятие материала до начала этиотропного лечения;
- соблюдение условий стерильности при сборе материала;
- техническую правильность сбора материала;
- достаточное количество материала;
- обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
- сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.
Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.
Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.
Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.
Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.
Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).
Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.
Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.
Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.
Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.
Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.
Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.
Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.
Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.
Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.
9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
морфология и тинкториальные свойства
культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
серологические свойства (антигенные)
вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
патогенность для животных
фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
чувствительность к антибиотикам
другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 11. Схема изучения колоний
|
Возможные характеристики колоний |
||
|
Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
||
|
Величина, мм |
Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
|
|
Характер поверхности |
Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
|
|
Бесцветные, окрашенные |
||
|
Прозрачность |
Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
|
|
Характер краев |
Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
|
|
Внутренняя структура |
Гомогенная, зернистая, неоднородная |
|
|
Консистенция |
Вязкая, слизистая, крошковидная |
|
|
Эмульгирование в капле воды |
Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
| " |
4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов
А, В и С
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ: ФГУН
Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора
(Л.А.Кафтырева, З.Н.Матвеева, Г.Ф.Трифонова); ГОУВПО
"Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им.
И.И.Мечникова" Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию (А.Г.Бойцов).
3. УТВЕРЖДЕНЫ
Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 декабря 2007
г. 0100/13745-07-34
4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с
момента утверждения.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Область применения
1. Область применения
1.1. В методических
рекомендациях изложены основные принципы и особенности
бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С;
содержатся современные сведения о биологических свойствах
возбудителей, резистентности к антибактериальным препаратам, о
питательных средах для их выделения и особенностях дифференциации
возбудителей брюшного тифа и паратифов от других серологических
вариантов сальмонелл.
2. Список сокращений
АБП - антибактериальный
препарат
ВСА - висмут-сульфит
агар
ЛПУ -
лечебно-профилактическое учреждение
МПК - минимальная
подавляющая концентрация
П
- промежуточный
У
- устойчивый
Ч
- чувствительный
РИФ - реакция
иммунофлюоресценции
ЦНС - центральная нервная
система
В
таблицах:
"+" - положительная
реакция в первые сутки;
"-" - отрицательная
реакция на 4-20 сутки;
"(+)" - замедленная
положительная реакция на 2-20 сутки;
d
- различные ферментативные реакции.
Возможна дифференциация
на ферментативные варианты.
3. Общие положения
3.1. Брюшной тиф и
паратифы А, В и С являются антропонозными кишечными инфекциями,
вызываемыми микроорганизмами Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi
A, Salmonella Paratyphi В и Salmonella Paratyphi С. В настоящее
время чаще регистрируется брюшной тиф, реже - паратиф В, редко -
паратиф А и крайне редко - паратиф С.
3.2. Заболевания
характеризуются язвенным поражением лимфатической системы тонкой
кишки, бактериемией, лихорадкой, циклическим клиническим течением с
выраженной интоксикацией, розеолезной сыпью на кожных покровах
туловища, гепато- и спленомегалией. Более характерен запор, нежели
диарея. Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки примерно в
1% случаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника
с самыми неблагоприятными последствиями для больного.
3.3. Диагноз брюшного
тифа и паратифов А, В и С ставится на основании клинических
признаков болезни с учетом эпидемиологического анамнеза и данных
комплексного лабораторного обследования, которое включает
классические бактериологический и серологический методы.
Бактериологическая диагностика имеет приоритетное значение, т.к. в
этом случае удается получить наиболее полную информацию о
биологических свойствах возбудителя, включая его чувствительность к
антибактериальным препаратам.
3.4. Применение
антимикробных препаратов для этиотропной терапии брюшного тифа и
паратифов позволило, с одной стороны, снизить летальность с 10-20%
до уровня менее 1%, а с другой стороны - осложнило лабораторную
диагностику, т.к. нередко забор материала для лабораторного
исследования осуществляется уже после начала антибиотикотерапии.
Этот факт заставляет более тщательно подходить к вопросу выбора
материала для исследования, взятия исследуемого материала, техники
исследования.
3.5. Современной
особенностью эпидемиологии брюшного тифа является резкое увеличение
частоты завоза (заноса) инфекции с эндемичных по этому заболеванию
территорий, стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение
жителей России при выезде в эти страны и в процессе миграции внутри
страны. Другой особенностью является наличие обширного контингента
высокого эпидемиологического риска в виде лиц без определенного
места жительства, среди которых регистрируется высокая
заболеваемость брюшным тифом.
3.6. Данные методические
рекомендации составлены с целью унификации методов
бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С,
а также правильной интерпретации результатов лабораторного
исследования с учетом современных особенностей клиники, лечения и
эпидемиологической обстановки на конкретных территориях.
4. Показания к проведению бактериологической диагностики
Показанием к проведению
бактериологического исследования биологического материала на
наличие возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С является
необходимость обследования:
4.1) больных с
подозрением на тифопаратифозное заболевание, а также с лихорадкой
неясной этиологии, продолжающейся 5 и более дней;
4.2) лиц, общавшихся с
больными брюшным тифом и паратифами А, В, С;
4.3) работников отдельных
профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по
эпидемиологическим показаниям;
4.4) лиц перед
поступлением в стационары и специализированные санатории по
клиническим и эпидемиологическим показаниям;
4.5) лиц при оформлении
на стационарное лечение в больницы (отделения)
психоневрологического (психосоматического) профиля, дома
престарелых, интернаты для лиц с хроническими психическими
заболеваниями и поражениями ЦНС, в другие типы закрытых учреждений
с круглосуточным пребыванием;
4.6) больных брюшным
тифом и паратифами после исчезновения клинических симптомов
перенесенного заболевания перед выпиской из стационара;
4.7) лиц, переболевших
брюшным тифом и паратифами, во время диспансерного наблюдения;
4.8) хронических
бактерионосителей, выявленных среди работников отдельных профессий,
производств и организаций, при повторном поступлении на работу на
указанные предприятия и объекты;
4.9) секционного
материала при подозрении на заболевание брюшным тифом и
паратифами.
5. Материально-техническое обеспечение метода
5.1. Стандартное
испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения
для микробиологических лабораторий.
5.2. Питательные среды,
диагностические сыворотки и химические реагенты для
культивирования, выделения, идентификации и определения
чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей
брюшного тифа и паратифов А, В и С.
5.3. Для лабораторной
диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления
бактерионосителей должны использоваться питательные среды и
реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
6. Лабораторная диагностика брюшного тифа и паратифов
6.1. Принцип
бактериологического метода основан на обнаружении живых
микроорганизмов в различных биологических субстратах (кровь, моча,
кал, желчь, костный мозг, розеолы) в зависимости от стадии
заболевания. Для этого производят посев определенного количества
биологического материала на специальные питательные среды с
последующей инкубацией в термостате и идентификацией выросших
колоний микроорганизмов, характерных для S. Typhi, S. Paratyphi A,
S. Paratyphi В и S. Paratyphi С, по культурально-ферментативным
свойствам и антигенной характеристике.
6.2. Только
бактериологическое исследование может обеспечить точную постановку
этиологического диагноза и контроль освобождения организма от
возбудителя. В отношении дифференциальной диагностики брюшного тифа
и паратифов единственным методом является лабораторное исследование
биологического материала с выделением возбудителя и идентификация
его до уровня серологического варианта, т.к. клиническое течение
инфекционного процесса не всегда позволяет различить эти
нозологические формы.
7. Бактериологическое исследование
7.1. Выделение
возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С проводят по одной и
той же схеме бактериологического исследования биоматериалов.
7.2. Порядок сбора
материала для лабораторных исследований на тифо-паратифозные
заболевания определен СП
3.1.1.2137-06 .
7.3. Техника сбора и
транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории
описана в МУ 4.2.2039-05 .
7.4. Материалом для
бактериологического исследования с целью диагностики брюшного тифа
и паратифов являются:
кровь;
испражнения;
моча;
Возбудители могут быть
также выделены из:
розеол;
костного мозга;
грудного молока.
Материалом для
бактериологического исследования с целью выявления
бактерионосителей, согласно СП
3.1.1.2137-06 , являются:
испражнения;
моча;
желчь (дуоденальное содержимое).
7.5. Исследование
секционного материала проводится с целью уточнения диагноза.
7.6. Сбор биологического
материала для лабораторных исследований осуществляется до начала
этиотропного лечения: медицинским работником, заподозрившим
тифо-паратифозную инфекцию; при групповой и вспышечной
заболеваемости - специалистами учреждений Роспотребнадзора и
персоналом лечебно-профилактических учреждений. От
госпитализируемых больных материал для бактериологического
исследования забирается в приемном отделении стационара.
7.7. От лиц, общавшихся с
больными или носителями (контактными), сбор материала проводится
медицинскими работниками ЛПУ и других организаций и учреждений по
месту выявления больных.
7.8. Биоматериал для
лабораторного исследования сопровождают специальным направлением.
Доставка материала самими обследуемыми не допускается. При
невозможности своевременной доставки материала используют
консерванты и транспортные среды (табл.1).
8. Бактериологическое исследование крови
Показанием к исследованию
крови является подозрение на тифо-паратифозные заболевания или
лихорадочное состояние невыясненного происхождения (лихорадка
неясного генеза), наблюдающееся в течение 5 и более дней (СП
3.1.1.2137-06).
Соотношение кровь -
питательная среда должно быть 1:10-1:60. Количество независимо
отбираемых проб крови и время их взятия определяется лечащим врачом
согласно МУ 4.2.2039-05 при
лихорадке неясного генеза или согласно МУ 04-723/3 МЗ СССР (1984)
при подозрении на тифо-паратифозные заболевания. У больных,
получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо собирать
непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы
препарата.
При наличии лихорадки
оптимальным является взятие крови на фоне повышения температуры
тела (но не на пике температуры!). Посев на питательные среды
проводят непосредственно у постели больного.
При подозрении на
тифо-паратифозные заболевания для посева крови можно использовать
среду Рапопорт, 20%-й желчный бульон, мясопептонный бульон с
добавлением 1%-й глюкозы (во флаконах по 100 мл). Ранее
использовали посев крови в стерильную дистиллированную
(водопроводную) воду. Однако предпочтительнее использовать
специальные среды для посева крови.
Количество засеваемой
крови в разгар лихорадки может составлять 10 мл, в более поздние
сроки - до 20 мл (у детей - до 5 мл).
При лихорадке неясного
генеза продолжительностью более 5 дней, как правило, должны
исследоваться несколько проб крови. Взятие крови из вены проводят
согласно МУ 4.2.2039-05 . Это
необходимо для дифференциации истинной бактериемии от случайной
контаминации крови при венопункции (вероятность загрязнения пробы
вследствие случайного прокола сальной или потовой железы составляет
3%). Для посева крови в этом случае используют две среды: 1) среду
для аэробов и факультативных анаэробов и 2) среду для облигатных
анаэробов (например, "двойная" среда + тиогликолевая среда согласно
приказу МЗ СССР от 12.04.85 N 535) или универсальную среду для
аэробов и анаэробов.
Предпочтительно
использовать промышленно произведенные среды, разрешенные к
применению в России.
Посевы инкубируют при 37
°С в течение 10 суток с ежедневным просмотром. При этом флаконы с
"двойной" средой наклоняют, омывая плотную часть среды.
При отсутствии признаков
роста на 10-й день выдается отрицательный ответ.
При наличии признаков
роста (помутнение, покраснение среды Рапопорт, появление видимых
колоний на плотной части "двойной" среды) проводят высев
параллельно на полиуглеводную среду и плотную среду в чашках Петри
(кровяной агар в случае лихорадки неясного генеза и среда Эндо при
подозрении на тифо-паратифозные заболевания).
Прямой высев на
полиуглеводные среды проводят для сокращения сроков исследования,
исходя из предположения, что при посеве крови с высокой
вероятностью будет наблюдаться рост монокультуры возбудителя. Для
контроля этого предположения и выделения чистой культуры путем
откола отдельных колоний необходим параллельный высев на среду Эндо
или кровяной агар.
Если на этих средах
наблюдается рост монокультуры, то можно учитывать биохимические
свойства по полиуглеводной среде. Для контроля чистоты культуры
необходимо провести микроскопию мазка с полиуглеводной среды,
окрашенного по Граму. На этом этапе возможна также постановка
реакции агглютинации на стекле с соответствующими агглютинирующими
О- и Н-сальмонеллезными сыворотками и выдача предварительного
ответа.
Схема бактериологического
исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и
паратифы представлена на рис.1.
Рис.1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы
Рис.1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы
Схема бактериологического
исследования крови пациентов при лихорадке неясного генеза
представлена на рис.2.
Рис.2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза
Рис.2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза
Ход дальнейшей
идентификации культуры по культурально-морфологическим,
ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен
далее в соответствующих разделах.
9. Бактериологическое исследование испражнений
Пробы испражнений
отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно
вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой
бумаги. Материал собирается с помощью ложки-шпателя,
вмонтированного в крышку стерильного контейнера. В отсутствие
контейнера со шпателем для отбора материала используют любой
стерильный инструмент (стерильный деревянный шпатель, проволочная
петля, ложечка и т.п.). При наличии патологических примесей
необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но
свободные от крови. Образцы жидких испражнений отбирают с помощью
стерильной пластиковой пастеровской пипетки с замкнутым
резервуаром.
Объем забираемого
материала должен быть не менее 2 г. Оптимальным является взятие
материала в случае оформленного стула - в объеме грецкого ореха; в
случае жидкого стула его слой в контейнере должен быть не менее
1,5-2,0 см. Материал, помещенный в стерильный контейнер,
доставляется в лабораторию в течение 2 ч.
Если материал невозможно
доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант
(транспортную систему со средой). Объем материала не должен
превышать объема среды.
Испражнения должны быть
тщательно гомогенизированы в среде. Образцы могут храниться до
начала исследования в течение суток в условиях холодильника (4-6
°С).
Транспортные среды и
консерванты, используемые для выделения возбудителей брюшного тифа
и паратифов А, В и С, а также других возбудителей острых кишечных
инфекций, представлены в табл.1.
Таблица 1
Транспортные среды и консерванты, наиболее часто используемые для транспортирования испражнений
|
Название
среды |
Обеспечивает сохранение |
|
среда
Кэрри-Блер |
всех кишечных патогенов, включая кампилобактерии |
|
среда
Эймс |
всех энтеробактерий |
|
среда
Стюарт |
сальмонелл и шигелл |
|
глицериновая
смесь |
всех
энтеробактерий, кроме иерсиний; предпочтительна для шигелл |
|
фосфатная
буферная смесь |
всех энтеробактерий |
|
боратно-буферный раствор |
всех энтеробактерий |
|
физиологический раствор |
всех энтеробактерий, включая кампилобактерии |
Пробы испражнений,
собранные непосредственно из прямой кишки с помощью ректального
тампона, используют преимущественно для объективизации диагноза
(МУ 4.2.2039-05). Взятие
материала осуществляется средним медицинским персоналом. Как
правило, специальный зонд для взятия мазка входит в состав
транспортной системы. Важно отметить, что попадание транспортных
сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный
тампон должен погружаться в транспортную среду только после взятия
материала. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу
бедрами и ладонями развести ягодицы. Зонд-тампон вводят в задний
проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси,
собирают материал с крипт ануса. Осторожно извлекают зонд-тампон и
погружают его в транспортную среду. Транспортирование тампона без
среды не допускается.
В
лаборатории посев проб испражнений проводят непосредственно на
плотные дифференциально-диагностические питательные среды и
параллельно на среду обогащения.
Схема бактериологического
исследования испражнений представлена на рис.3.
Рис.3. Схема бактериологического исследования испражнений
Рис.3. Схема бактериологического исследования испражнений
Из нативных испражнений
готовят суспензию в 0,9%-м растворе хлорида натрия в соотношении
1:5-1:10, оставляют на 30 мин для оседания крупных частиц. После
этого одну каплю надосадочной жидкости засевают на чашки с плотными
питательными средами и 1 мл суспензии - в среду обогащения
(соотношение материал-среда должно быть 1:5).
Испражнения, доставленные
в лабораторию в консерванте (транспортной среде), перед посевом
должны быть тщательно гомогенизированы в среде, после чего проводят
прямой посев материала на плотные среды и среду обогащения в тех же
соотношениях, что и нативные испражнения.
Пробы испражнений,
собранные с помощью ректального тампона, исследуются аналогично
испражнениям, доставленным в консерванте. Следует помнить, что
ректальный тампон содержит меньшее количество микроорганизмов по
сравнению с нативными испражнениями, поэтому посевная доза должна
быть увеличена.
Максимальное выявление S.
Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi В и S. Paratyphi С в
испражнениях достигается при использовании сред обогащения, хотя у
больных в остром периоде заболевания возбудитель достаточно часто
выделяют и при прямом посеве. Посев на среды обогащения параллельно
с прямым высевом обязателен!
Все посевы инкубируют при
37 °С на дифференциально-диагностических средах 18-24 ч, на
висмут-сульфит агаре - 24-48 ч. Через 24 ч проводят высев со сред
обогащения на плотные среды (висмут-сульфит агар или среду Эндо).
Колонии, характерные для данных возбудителей, выросшие на плотных
средах, отсевают на полиуглеводную среду.
Необходимо отметить, что
техника распределения материала по поверхности чашки с плотными
средами должна обеспечить рост изолированных колоний типичного
вида, по которому можно визуально оценить культуральные свойства
микроорганизма.
Для выделения S. Typhi
предпочтительнее использовать висмут-сульфит агар (ВСА). Типичные
колонии S. Typhi имеют черный цвет и окружены черным или коричневым
ободком с металлическим блеском. Однако при обильном росте S. Typhi
часто не дает характерного почернения ВСА, поэтому чашки должны
быть засеяны так, чтобы обеспечить рост отдельных колоний.
Пробы фекалий можно
засевать на стандартные селективные среды для энтеробактерий,
разрешенные к применению на территории Российской Федерации. Тем не
менее, для выделения S. Турhi предпочтительнее всего использовать
висмут-сульфит агар. Ход дальнейшей идентификации культур по
ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен
далее в соответствующих разделах.
10. Бактериологическое исследование мочи
Посев мочи производят для
диагностики с первых дней заболевания и вплоть до выписки больного,
а также с целью выявления бактерионосительства. Так как при тифе и
паратифах выделение возбудителя с мочой происходит периодически и
кратковременно, исследования мочи необходимо проводить повторно с
промежутками 5-7 дней.
Следует строго
придерживаться общих правил сбора мочи, изложенных в МУ 4.2.2039-05 . Вне зависимости от
способа получения мочи, она должна быть доставлена в лабораторию в
течение 2 ч. В крайнем случае допускается хранение мочи в течение
ночи в холодильнике.
Следует помнить, что в
зависимости от химического состава мочи бактерии в ней могут при
хранении как отмирать, так и размножаться.
Увеличение срока
сохранения материала может крайне затруднить интерпретацию
результата.
Производят прямой посев
мочи (или осадка после центрифугирования) без предварительного
обогащения согласно приказу МЗ СССР N 535 на плотные
дифференциально-диагностические среды, рекомендуемые для
сальмонелл, в том числе возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Параллельно нативная моча засевается в среды обогащения двойной
концентрации в соотношении 1:1 или осадок мочи - в среды обычной
концентрации. Посевы помещают в термостат при 37 °С на 18-24 ч, а
затем со среды обогащения производят высев на плотные
дифференциально-диагностические среды. Колонии, выросшие на плотных
средах, идентифицируют по культурально-ферментативным и
серологическим свойствам.
11. Бактериологическое исследование желчи (дуоденального содержимого)
Желчь собирают в три
стерильные пробирки или стерильные одноразовые контейнеры раздельно
по порциям А, В, С согласно МУ
4.2.2039-05 и доставляют в лабораторию.
Проводят исследование
каждой порции (А, В, С) отдельно или готовят смесь из трех порций.
Пробы засевают:
на плотные дифференциально-диагностические
среды (ВСА, Эндо, ЭМС или др.) в количестве 0,5 мл;
в пробирку (флакон) с питательным бульоном
в соотношении 1:10. Нет необходимости засевать желчь на среды
обогащения, т.к. желчь сама является хорошей питательной средой для
возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Засеянные среды вместе с
остатками желчи инкубируют при 37 °С.
Через 18-24 ч
просматривают посевы на плотных питательных средах (результаты
роста на ВСА учитывают через 24 и 48 ч) и делают пересев
подозрительных колоний на полиуглеводную среду.
Из питательного бульона
производят высевы на плотные дифференциально-диагностические
среды.
Из оставшейся желчи в
случае отрицательного результата прямого посева делают повторные
высевы на плотные дифференциально-диагностические среды через 18-24
ч и на 3, 5, 7 и 10 сутки.
Проводят идентификацию
выросших микроорганизмов по культурально-морфологическим,
ферментативным и серологическим свойствам.
12. Бактериологическое исследование материала из розеол
Бактериологическое
исследование ("соскоб" с розеол) проводят при наличии хорошо
выраженных розеол. Материал собирают асептически. Для этого участок
кожи над розеолами обрабатывают 70%-м этиловым спиртом, затем
протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9%-м раствором
хлористого натрия и осушают стерильным тампоном.
Материал для исследования
(тканевую жидкость) получают путем скарификации кожи над розеолой с
помощью скальпеля. На поврежденную кожу наносят 1-2 капли желчного
бульона или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают с
выступившей тканевой жидкостью и собирают пастеровской пипеткой или
аналогичным одноразовым стерильным устройством в пробирку с одной
из жидких сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.). В
лаборатории посев выдерживают при 37 °С 18-24 ч с последующим
высевом на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо,
ЭМС, ВСА).
13. Бактериологическое исследование костного мозга
Хорошо известно, что при
лабораторном подтверждении диагноза "брюшной тиф" наиболее
результативным является бактериологическое исследование костного
мозга (высеваемость возбудителя составляет 90-95%). Даже у
пациентов с легкими и стертыми формами брюшного тифа, трудными для
клинического распознавания, а также на фоне приема антимикробных
препаратов, высеваемость миелокультур значительно выше, чем
гемокультур.
Однако на практике
бактериологическое исследование костного мозга проводится очень
редко, только по особым клиническим показаниям, при отсутствии
других лабораторных данных, подтверждающих диагноз брюшной тиф или
паратиф, т.к. эта инвазивная процедура достаточно травматична.
Забор материала для исследования проводят только в условиях
стационара при наличии соответствующего специалиста.
Материал для
бактериологического исследования (аспират) в количестве 0,50-0,75
мл получают асептически, путем проведения пункции грудины (рукоятки
или тела) и засевают в пробирку с одной из сред обогащения (желчный
бульон, среда Рапопорт и др.).
Если аспират невозможно
засеять в среду обогащения сразу после пункции, его собирают в
стерильную пробирку и немедленно направляют в лабораторию, где
производится посев в среду обогащения. В лаборатории посевы
инкубируют при 37 °С 18-24 ч с последующим высевом на плотные
дифференциально-диагностические среды.
Дальнейшее исследование
проводят, как при бактериологическом исследовании другого
биологического материала.
14. Питательные среды и реактивы
Перечень питательных сред
для выделения и идентификации возбудителей кишечных инфекций, в
частности энтеробактерий, обширен и неуклонно расширяется. Выбор
конкретных сред во многом обусловлен местными экономическими
условиями и традициями. Тем не менее, при этом следует
руководствоваться несколькими основными принципами.
14.1. В описании
питательной среды должно быть указано, что она может быть
использована не просто для выявления сальмонелл, а именно
Salmonella Typhi и S. Paratyphi А, В и С.
14.2. Следует отдавать
предпочтение сухим питательным средам известных производителей по
сравнению со средами, непосредственно изготовляемыми в
лаборатории.
14.3. Каждая партия
питательной среды в лаборатории должна контролироваться с помощью
тест-штаммов (внутренний контроль качества).
14.4. Для лабораторной
диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления
бактерионосителей должны использоваться питательные среды и
реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.
15. Методы изучения ферментативных свойств
В
настоящее время для изучения ферментативной активности
микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включая возбудителей
брюшного тифа и паратифов, разработаны, выпускаются и
зарегистрированы различные диагностические тест-системы
отечественного и зарубежного производства (от наиболее простых
классических сред Гисса в пробирках и планшетах до автоматических
анализаторов). Если тест-системы позволяют идентифицировать
микроорганизм до уровня рода и выявлять особенности ферментативной
активности штаммов, то они могут быть использованы для
идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов. Методика
работы с тест-системами подробно изложена в инструкциях по
применению и их следует строго соблюдать.
16. Биологические свойства возбудителей
Возбудители брюшного тифа
и паратифов А, В и С относятся к семейству Enterobacteriaceae, роду
Salmonella, виду enterica, подвиду I (enterica) и обладают
морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами,
характерными для данного подвида, вида, рода и семейства.
У
представителей рода сальмонелл вида enterica исторически сложилась
ситуация, когда для обозначения сероваров использовали не
антигенную формулу, как у других бактерий, а названия болезней
(человека или животных), страны, города или улицы, где они были
выделены, и др. Ошибочно считать эти названия видовыми, т.к. они не
имеют таксономического статуса. Тем не менее, названия наиболее
часто встречающихся сероваров сальмонелл настолько привычны, что
заменить их антигенными формулами практически нереально. Поэтому в
современной схеме Кауфмана-Уайта при обозначении сальмонелл только
вида enterica подвида I вместо видового обозначения используют
название серовара, но пишут его с заглавной буквы.
Таким образом, полные
названия возбудителей брюшного тифа и паратифов следующие:
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhi;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi A;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi B;
Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Paratyphi С
В
обычной практике возможно использование сокращенных вариантов
названий:
Salmonella ser. Typhi или Salmonella Typhi
или S. Typhi;
Salmonella ser. Paratyphi А или Salmonella
Paratyphi А или S. Paratyphi A;
Salmonella ser. Paratyphi В или Salmonella
Paratyphi В или S. Paratyphi B;
Salmonella ser. Paratyphi С или Salmonella
Paratyphi С или S. Paratyphi С
16.1. Культурально-морфологические свойства
Подвижные
грамотрицательные палочки не образуют спор и капсул, факультативные
анаэробы хорошо растут на обычных питательных средах.
На простом питательном
агаре - слегка выпуклые с ровным краем и гладкой поверхностью,
влажные с блеском колонии более 1 мм.
На
дифференциально-диагностических средах (содержащих лактозу как
дифференцирующее вещество) - прозрачные, бесцветные или
голубоватые, а иногда розоватые или цвета среды колонии (среды
Эндо, Плоскирева, ЭМС и другие аналогичные среды).
На SS-arape - колонии
цвета среды с черным центром.
На висмут-сульфитной
среде - изолированные колонии S. Typhi, S. Paratyphi В - черные с
характерным металлическим блеском, среда под колонией прокрашена в
черный цвет. Колонии S. Paratyphi A - зеленоватые, светлые в цвет
среды, нежные.
Штаммы S. Paratyphi В
(возбудитель паратифа В) на мясопептонном агаре могут образовывать
по периферии колоний приподнятый слизистый вал. Слизистый вал
развивается на 2-5 сутки при хранении посевов при комнатной
температуре. Этот признак не является постоянным и
диагностическим.
16.2. Ферментативные свойства
Изучение ферментативных
свойств проводится в отношении набора углеводов, многоатомных
спиртов, аминокислот и других органических соединений, применяемых
при идентификации и изучении сальмонелл и других энтеробактерий.
Как правило, в практических лабораториях используют небольшое
количество тестов, позволяющих идентифицировать основные роды,
входящие в семейство кишечных бактерий. Характеристика
ферментативных свойств сальмонелл, включая возбудителей брюшного
тифа и паратифов А, В и С, представлена в табл.2.
Таблица 2
Ферментативные свойства возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В, С
|
Субстрат |
S. Paratyphi
A |
||||
|
Глюкоза
(газ) |
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию (разведение с изотоническим раствором NaCl и т.п.)
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
· морфология и тинкториальные свойства
· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов, гликолитическая, протеолитическая и др. активность)
· серологические свойства (антигенные)
· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
· патогенность для животных
· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
· чувствительность к антибиотикам
· другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводиться в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 12). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 12. Схема изучения колоний
| № | Признак | Возможные характеристики колоний |
| 1. | Форма | Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
| 2. | Величина, мм | Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
| 3. | Характер поверхности | Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
| 4. | Цвет | Бесцветные, окрашенные в … цвет |
| 5. | Прозрачность | Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
| 6. | Характер краев | Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
| 7. | Внутренняя структура | Гомогенная, зернистая, неоднородная |
| 8. | Консистенция | Вязкая, слизистая, крошковидная |
| 9. | Эмульгирование в капле воды | Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа или под лупой.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина вмолекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных иконечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
